第3讲DNA的复制机理与PCR技术1-2014概念.pptVIP

第3讲 遗传学中的“中心法则” DNA的复制机理与PCR技术 一、复制的基本规则 1. DNA复制是半保留的 2. 复制起始出现在称为原点的特定序列上 3. 复制的控制一般是在复制的起点处 4. 复制叉的移动是单向或双向或相向 5. 链的延伸方向是5′到3′方向 6. 大多数情况下DNA复制是半不连续的 7. 在存在模板的条件下，DNA聚合酶可以以短的 RNA片段作为引物开始合成新的DNA片段 8. 还存在各种其它的DNA链的合成起始机制，即除了RNA引发外，另外还有一些途径，包括：DNA链与一个末端蛋白共价结合，以及缺口的共价延伸，或者亲本链已被环出末端等 9. 复制终止往往是在复制过程中的某个固定点处 10. 复制的机制取决于基因组结构和构象来保持产生完整的染色体 11. 即使在一个单细胞中也可进行多种复制机制的操作 二、DNA的半保留复制  Replication of DNA is semiconservative 三、复制的起点、方向与方式 (1) 复制原点：常用ori或o表示，例如大肠杆菌的复制原点位于ivl基因附近，是一个包括约245bp的DNA区段。 a. 原核生物：通常只有一个复制原点； b. 真核生物：通常具有多个复制原点； c. 复制子：基因组中能独立进行复制的单位，一个复制子中只有一个复制起点。 通常细菌、病毒、线粒体DNA分子都是作为单个复制子完成复制， 质粒是一个自主复制的环状DNA分子，构成一个独立的复制子。 真核生物基因组DNA分子上有多个复制子。 细菌的复制子具有以下功能： ① 起始一个复制循环； ② 控制起始事件的频率； ③ 把完成复制的染色体分配到子细胞中去。 真核生物的原点没有分配功能，只与复制有关。 DNA复制起始区段的结构特点是： （1）富含A－T碱基序列，这可能与双链易于解开起始复制有关； （2）含有多个回文结构（通常是9－14个GATC） 8个GATC较保守, GATC中的“ A”已甲基化; （3）具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点； （4）此顺序的右侧邻近区段有两个启动子，它可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起转录激活作用。 (2) DNA复制的方向： DNA是从一个起始位点开始复制的，复制的调控主要就是复制起始的调控。一旦复制开始，就一定要完成，达到复制子的终点。 从起始位点开始后，DNA有三种复制方式：单方向的（Unidirectional Replication）；或双方向的（bidirectional replication.）；或相向的（如一些病毒线性DNA中）。 复制叉（replication fork）：又称生长点（growing point），是复制原点起动DNA复制后形成的一种结构，即复制正在发生的位点。正在复制的DNA因复制叉的移动会形成各种各样的结构： ①θ（theta）structure: 环状DNA复制时在特定区域由于DNA双链分开而产生的一种结构。 ② Displacement (D) Loop: 在环状或线状染色体上以一条DNA链为模板在一个方向合成一条子链所产生的结构。 最典型的D-loop结构主要产生于哺乳动物线粒体的DNA复制过程中。 ③ Bubble (eye) and Y structure: 线状染色体DNA复制起始后产生的一种结构。 ④ Lariat ( sigma) forms: 是在一个环状染色体上由一个亲本链的共价延伸所产生的结构。 四、参与DNA复制的酶和蛋白质 1、DNA旋转酶：即拓扑异构酶 DNA拓扑异构酶是催化DNA环的拓扑异构体之间转化的酶，它可催化一个DNA单链或双螺旋链穿过另一个单（双）链；进而产生负超螺旋并消除复制叉移动所产生的正超螺旋。 2、DNA Helicase(解旋酶)：水解ATP,利用ATP释放的能量驱动两条盘旋的双螺旋链的解开，主要结合在复制叉上。在DNA的复制、修复、重组、引发等中都有重要的功能。 3、单链结合蛋白Single-strand binding protein(SSB)： 专一结合单链DNA、保持单链DNA的稳定性，免受DNA酶的降解、触发单链DNA的结构变化，利于起始DNA链的模板作用等等。 4. DNA聚合酶 一类依赖模板链、根据碱基互补原则，合成新的DNA链的酶叫做DNA聚合酶。 只有真正参与了DNA复制的一部分聚合酶，有时这一部分聚合酶就被叫做DNA复制酶。 (1) 原核生物的聚合酶 一个β二聚体加上一个γ复合物识别一个引物及模板形成一个前起始复合物。在这个反应中，γ复合物切断ATP并将