实验七营养缺陷型菌株的筛选要点.pptVIP

营养缺陷型菌株的筛选 实 验 七 营养缺陷型等基本概念 与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体： 野生型：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。遗传型表示法是[A+B +] 营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长。 A营养缺陷型用[A-B +]表示，B营养缺陷型用[A+B -]表示 原养型：一般指营养缺陷型突变经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。 遗传型均用[A+B +]表示 与营养要求有关的3种遗传型关系 培养基的基本概念（按营养需求成分分） 与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基： 基本培养基（MM）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基。——不同菌株的要求不同，此试验要先确定，非常重要。 完全培养基（CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。 补充培养基：凡只能满足相应的营养缺陷突变株生长需要的组合或半组合培养基。 营养缺陷型的用途 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大，主要有两方面应用： 1、是作为研究代谢途径和遗传规律及育种技术不可少的标记菌种； 2、可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物——目的在于切断某些代谢途径以积累中间代谢产生或切断一条代谢途径而积累另一分支途径的末端产生。 ——解除代谢途径中的反馈抑制和阻遏。 目的要求 1、了解应用物理、化学因素对细菌进行诱变的方法。 2、初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛选与鉴定的方法技术。体会其相应的科学理念。 实验原理——诱变及诱变剂说明 利用化学、物理等诱变手段诱发突变是遗传学研究和育种工作的常用手段。 主要有DNA碱基化学性质改变引起置换、插入移码、大片段畸变、碱基二聚体形成等。最终引起遗传信息在复制中的改变。 本次实验利用紫外线进行诱变处理（主要是形成嘧啶二聚体，引起后续DNA复制错误，达到诱变的目的）。 诱变后需要暗培养（防止光复活作用）。 紫外线剂的控制——紫外灯的功率、照射距离、照射时间。——（需要前期试验确定，杀菌率在70%左右） 实验原理——营养缺陷型的培养生长情况 营养缺陷型在完全培养基（CM） 上生长良好，而在基本培养基（MM） 上则不生长； 未发生突变的野生型在两种培养基上都能生长。 ——筛选的理论依据 实验原理——营养缺陷型筛选的四个环节 第一步：诱变剂处理 第二步：淘汰野生型，浓缩缺陷型——基本培养基（使营养缺陷型由少数变为多数） 　抗生素法：青霉素适用于细菌；制霉菌素适用于真菌 　菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放线菌 高温杀菌法：利用芽孢和营养体对热敏感性的差异。 第三步：检出缺陷型 第四步：鉴定营养缺陷型（此步因时间关系不再进行） 实验材料 菌种：大肠杆菌 实验培养基：肉汤液体培养基（CM） ；肉汤固体培养基（CMA）； 2倍肉汤液体培养基（2×CM） ；基本液体培养基（MM） ；基本固体培养基（MMA） ；无N基本液体培养基（无N） ；2倍含N基本液体培养基（2×N） 实验试剂：生理盐水；青霉素钠 实验器材：10mL带盖离心管、10mL吸管、90mm培养皿、15×150mm试管（带硅胶塞）、1mL刻度吸管（或微量加样枪和吸头） 实验步骤 1、菌种培养收集洗涤 2、诱变剂处理 3、淘汰野生型，浓缩缺陷型——基本培养基 　抗生素法：青霉素适用于细菌；制霉菌素适用于真菌 　菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放线菌 4、检出缺陷型——夹层培养法 5、鉴定营养缺陷型（此步骤因时间关系不再进行）——下学期《微生物学实验》中有相关内容学习 1、菌种培养收集洗涤（第一天） 大肠杆菌接种于肉汤液体培养基，37℃静止培养18~24小时（老师处理）。 无菌取10mL培养液放入无菌15mL离心管中，3500转/分钟离心10分钟，弃上清液，留下菌体沉淀。 在上述沉淀中加入5mL无菌生理盐水，悬浮沉淀（均匀），备用。 2、诱变剂处理（第一天） 吸取上述洗涤悬浮好的菌悬液3mL，放至60mm培养皿中，摇晃成薄层。 将上述培养皿（连盖）放在40W的紫外灯下，距离30厘米（处理前先开紫外灯稳定30分钟），灭菌1分钟，然后开盖处理5分钟。照射完毕后，先盖上皿盖，再关紫外灯。 吸取3毫升2倍肉汤培养液到上述处理后的培养皿中。置于37℃恒温培养箱内，避光培养12小时以上。——诱变后DNA复制形成纯合子过程。 注意紫外线防护（不要长时间暴露在其下）。 3、淘汰野生型，浓缩缺陷型（第二天） （1）吸5毫升紫外线处理过并重新培养的菌液，放入已灭菌的15mL离心管，3500转/分离心10分钟。 （2）倒去上清液，加入