实验三外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与检测要点.pptVIP

实验四 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与检测 讲师：王聪艳 一、实验目的： 1、了解外源基因表达常用的载体及其特点。 2、通过本实验掌握原核基因表达产物分离的方法。 3、通过本实验掌握原核基因表达检测的方法。 二、实验原理： 1、大肠杆菌是分子生物学研究中表达外源基因的最常用的模式细胞之一，外源基因与通过特殊原核表达载体转化大肠杆菌细胞。常见载体有冷休克表达载体pCold?系列载体和pET表达载体系统。 pCold?系列载体是利用大肠杆菌冷休克基因CspA启动子序列和5’非编码区的蛋白质表达系统。在CspA启动子下游插入了lac operator，可以严格调控目的基因的表达。可采用低温诱导载体及携带表达的方法，使大肠杆菌自身的蛋白质合成受到抑制、目的蛋白质获得高效表达。和以前的大肠杆菌表达系统-pET系统相比，在蛋白质表达量和可溶性上有所提高。  pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的系统。目标基因被克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶来诱导目标基因表达。 二、实验仪器、用具、药品 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、电磁炉、水浴锅、 微量移液器、注射器、 Ecoli （pET-32a空载体）、 Ecoli （ pET-32a 携带外源基因）、 Ecoli （无载体）IPTG 、标准分子量蛋白等。 三、实验步骤： 1、聚丙烯酰胺凝胶的配制 将以上各成分混合后灌胶，以蒸馏水封胶，胶聚合30-60 min后，用滤纸将水吸出。 加入上述浓缩胶, 插入梳子，聚合15～60 min。 2、 取检测为阳性的含重组质粒的大肠杆菌 100 μl接种至6 ml含有抗生素的LB液体培养基中，37℃，振荡培养过夜。1:20比例稀释菌液，取500 μl菌液转接到10 ml含抗生素的LB液体培养基中，37℃，180 r/min，振荡培养2-3 h，至OD600到0.5时，37 ℃水浴30　min后，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达， 37 ℃条件下振荡培养，12 h后取样。 同时做对照组：含有pET-32a空载体的大肠杆菌。 Ecoli （无载体）。 3、蛋白质样品的制备 分别取1 ml菌液，12000 r/min，离心2 min，弃上清，再取1mi重复一次，加入100 μl 上样缓冲液悬浮沉淀，置水浴煮沸5 min，冰上放置5 min，12000 r/min，离心5 min，取上清点样。 4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 在电泳槽中加入电极缓冲液，连接电源，电泳至溴酚蓝行至电泳槽前沿时停止(需约4 h)。 5、染色、脱色 将胶从玻璃板中取出，用考马斯亮兰染色液室温染色1-2 h。将胶从染色液中取出，在脱色摇床慢摇脱色，更换两次脱色液后，将胶置于含冰乙酸(1:1000)的蒸馏水中，脱色至条带清晰。 6、将脱色好的胶板拍照 四、结果分析与讨论 分析对照组pET-32a空载体的大肠杆菌与含有外源基因的菌体经诱导后的蛋白表达情况 * * *