第三章基因工程制药4节研讨.pptVIP

上次内容回顾（1） 基因工程技术？ 基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 第一个基因工程产品？ 1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。 基因工程的方法生产医药的优点体现在哪些方面？ 大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足、扩大了药物筛选来源。 上周内容回顾（2） 制备基因工程药物的一般程序？ 获得目的基因 组建重组质粒 构件基因工程菌或细胞 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装 生物制药所用菌种的获得途径有哪些？ 诱变育种、基因工程构建、细胞工程、自然界分离 从真核中获得目的基因的基本方法有哪些？ 主要方法有：异转录法、RT-PCR法、化学合成法 (编码序列富集法、岛屿获救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建cDNA文库、差异显示技术的应用，对已发现基因的改造) 第四节 基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。（四点） 一、宿主细胞的选择（1） 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: （1）容易获得较高浓度的细胞； （2）能利用易得廉价原料； （3）不致病、不产生内毒素； 一、宿主细胞的选择（2） （4）发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； （5）容易进行代谢调控； （6）容易进行DNA重组技术操作； （7）产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。 一、宿主细胞的选择（3） 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 ⒈ 原核细胞 ⑴大肠杆菌 因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 大肠杆菌用于基因表达的特点 ?表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。极少数情况下还可分泌到细胞外表达。 ?大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取时需要破碎细胞，故细胞质内其它蛋白质也释放出来，造成提取困难。 ?因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复其生物活性。 ?蛋白质产物不能糖基化。只适于表达不经塘基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白 ?产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。 ?其内毒素很难除去。 ?产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。 ⑵ 枯草芽胞杆菌 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。从而使其应用受到影响。 ⑶ 链霉菌 作为外源性基因表达受到重视。特点：不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物直接分泌到培养基中、表达产物可糖基化。 ⒉ 真核细胞 ⑴ 酵母 酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能胞外分泌表达产物，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。如干扰素、乙肝表面抗原基因等。 ⑵ 丝状真菌 优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化），糖基化方式与高等真核生物相似。有成熟的发酵和后处理工艺。 ⑶ 哺乳动物细胞 优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。 目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母,已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。 二、大肠杆菌中的基因表达 大肠杆菌做为外源基因的表达宿主，遗传背景清楚，技术操作简便，培养条件简单，大规模发酵经济，因此倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系，并常常作为高效表达研究的首选体系。 原核细胞的基因组特点： ①染色质为环状双股DNA