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考马斯亮蓝法测蛋白质含量研讨
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。 ⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。 ★考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 ★在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比 ⒈器材。 可见分光光度计、试管、试管架、刻度移液管、移液枪 ⒉试剂。 ⑴水 ⑵考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至1000ml，存于棕色瓶。 ⑶蛋白质标准溶液 准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置1mg/ml标准溶液。 ㈠标准曲线的制作 取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。 1 2 3 4 5 6 V（标准蛋白溶液）／μl 0 20 40 60 80 100 V(水）／μl 100 80 60 40 20 0 Ρ(蛋白质含量）／（μg／0.1ml) 0 20 40 60 80 100 试管编号 试剂 每支试管加入5ml考马斯亮蓝试剂 振荡混合后放置5分钟 于595nm测定吸光度 A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标 绘制标准曲线 ㈡样品提取液中蛋白质含量的测定 取3支试管，各吸未知浓度 蛋白液0.1ml，分别加考 马斯亮蓝试剂5ml 振荡混合放置5分钟 以制作标准曲线的1号试管 做空白对照，595nm测吸光度 据所测A595值，于标准曲线 上查出相当标准蛋白的量，取 三重复样品蛋白含量均值 ㈢结果计算 样品蛋白质含量 ug/ml 五、注意事项 ⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100~800μg／ml为宜。 ⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面，对后续测定造成影响，因此测定结束后用无水乙醇清洗比色皿。 * ml * ml
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