3基因表达检测课件.ppt

养成良好的实验习惯； 学会严谨的逻辑思维，分析推理的能力； 准确、精炼的表达自己的研究成果，善于和同行沟通和交流。 大家应该注意培养和锻炼的三方面能力： * 真核生物中有5.8S、18S、28S和5S四种rRNA，前三种rRNA为主体rRNA； 原核生物有5S、16S、23S三种rRNA 总RNA中80％－85％是核糖体RNA，剩余的15％－20％的为不同的相对低分子质量的RNA组成（如tRNA和小核RNA） mRNA占总RNA的1％－5％。 第三部分：基因表达检测 基因表达检测的应用范畴 检测自然变异等位基因的表达差异； 检测突变体基因功能的丧失或获得； 检测转基因的表达：OX 抑制 突变。 基因表达检测的技术手段 RT-PCR (Reverse transcription PCR) Real-time PCR=qRT-PCR Northern Blotting RT-PCR (qRT-PCR) RNA抽提 cDNA 反转录 基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导 PCR Northern Blotting 基因表达分析的一般流程 Northern Blotting Invented by Kary Mullis in 1983 and Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993 基因表达水平 mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR； RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 实验原理 总RNA 提取 RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的； RNA的纯度和完整性对于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要； RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。 被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手、口、头发等 RNA操作中应注意的关键问题： 防止RNase污染 外源RNase的主要来源： 处理并专用：移液器、玻璃器皿、离心管、枪头、溶液、缓冲液、RNA电泳装置用0.1％的DEPC在37oC处理溶液1小时后，有的再高压蒸气灭菌15 min，烘干备用； 180－300oC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品； 也可使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等； 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。 防止外源RNase污染的主要措施 材料要新鲜、取样离体时间要短并快速冷冻； 裂解过程要同RNase活性抑制同步：快速冷冻。 防止内源RNA酶降解RNA RNA酶抑制剂 RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。 用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有： DEPC（焦碳酸二乙酯 ）：形成组胺基团破坏RNase的活性； 氧钒核糖核苷复合物：能与多种RNA酶活性位点结合RNA酶； 蛋白质抑制剂：可与RNase形成非共价的复合物。 实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳 带评价RNA质量 实验材料：水稻幼嫩叶片 苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可 配合氯化铯离心或有机溶剂提取。 Trizol Reagent 提取方法 利用Trizol试剂抽提植物总RNA原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA; 用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。 75％乙醇（in DEPC-treated water) 氯仿、异丙醇（RNA专用） RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净； 玻璃器皿180oC烘烤3 hr