综述：大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战绪论.docx

大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战毫无疑问，重组蛋白在微生物中的表达革新了生物化学领域。以前，纯化少量的目的蛋白需要处理几千克的动物或植物组织，或是大量的生物体液，这个时代已经一去不返了。对于每个研究者来说，如果他要开始一个项目，需要某种纯化的蛋白。他马上就会想到，怎样通过重组表达的方式获得这种蛋白。目的重组蛋白的大量表达使人们能够对其生物化学性质进行分析，将其应用于工业并发展成为商业化产品。从理论上来讲，获得重组蛋白的过程相当直接：获得目的基因，克隆到表达载体，转入表达宿主，诱导，纯化。然而，实际上，事情通常并不是这样。宿主菌生长差，包涵体的形成，蛋白无活性，甚至无法获得任何蛋白，这些都是实验中会遇到的问题。在过去，有许多综述详细地介绍了这个课题。综合来说，这些论文收集了2000多个例子。然而在重组蛋白表达纯化领域，一直都在进步着。因此，在本综述中，我们对本领域最近取得的进展做了评述。同时，对于那些那些对异源表达还不大熟练的研究人员，我们通过回答项目开始就需要解决的问题，提供的许多选择和方法，。这些选择和方法，在过去的几十年里，曾被成功的用来表达一系列的蛋白。问题一：选择哪种生物体作为表达宿主？整个过程的开始就是要选择宿主细胞，利用它的蛋白合成机制来获得珍贵的蛋白。宿主的选择决定了我们以后所需要的技术，包括各种分子工具，仪器或者试剂。在这些微生物体中，现有的宿主系统包括细菌，酵母，filamentous fungi, 和 unicellular algae。他们各有优点和缺点，宿主的选择可能取决于我们要表达的蛋白。例如，如果目的蛋白需要翻译后的修饰，那么我们就要选择真核表达系统。在本篇综述里，我们主要详细介绍大肠杆菌表达系统。众所周知，利用大肠杆菌作为宿主具有很多优点。1.它有无可比拟的快速生长机制，在glucose-salts培养基中，以及在最优的环境条件下，它扩增一倍的时间大约是20分钟。这意味着以1/100接种的菌液在几个小时就可以生长至饱和。然而，需要注意，重组蛋白的表达可能对微生物体的造成代谢压力，导致菌体扩增大幅减慢。2.高浓度细胞培养物较容易实现。在液体培养物中，理论的浓度估计最低大约是200g 细胞干重/l 或者1×1013个活力细胞/ml.然而，细菌在复合培养基中的指数生长是的它的浓度远没有达到这个值。在最简单的实验设置中（例如：37℃，在LB培养基中生长），细菌最高能长到1×1010/ml,还不到理论值的0.1%。因此，甚至为了获得重组蛋白，我们也需要一种高浓度细胞培养的方法以促进大肠杆菌的生长。作为一个重负荷机器的有机体，由于对其生理的深入研究，这些策略不断的出现。3.用一些廉价的成分，可以很容易的配制富营养的复合培养基。4 DNA的转化方便而且快捷。质粒转入大肠杆菌中甚至可以在5分钟内完成。问题二：选择哪一个质粒?目前最普遍使用的质粒是复制子，启动子，选择标记，多克隆位点组合和融合蛋白以及融合蛋白切除策略多个因素组合的结果。因此，表达载体的种类是非常多的，人们常常不知道选择哪一个才好。想要做一个明智的决定，这些特征需要根据每个人的需要认真的评价。复制子基因单元如质粒能够自动的复制，都包含有复制子。复制子是由复制起点以及相关的反式作用元件。选择一个合适载体的一个重要的参考因素是它的拷贝数。拷贝数是由复制子控制的。通常人们会认为，高含量的质粒会得到更多的重组蛋白，因为细胞内存在大量的表达单位。然而，大量的质粒会造成代谢压力，减缓细菌生长，可能会是质粒变得不稳定，因此，能有效合成蛋白的生物体减少。所以，高拷贝质粒无论如何不会提高蛋白产量的。通常使用的载体，例如pET系列载体，具有pMB1复制起点（ColE1衍生，每个细胞有15-60个拷贝），而在pUC系列中存在pMB1复制起点的一个突变的类型型（500-700个拷贝每个细胞）。ColE1复制起点（15-20个拷贝/细胞）的野生型存在于pQE载体中。这些复制起点是不兼容的，在同一个细胞内会相互竞争复制机制，所以他们不能在同一细胞内扩增。想要利用两个质粒进行双表达，可以使用带有p15A复制起点的表达系统（pACYC和pBAD系列载体，10-20拷贝/细胞）。三表达可以使用pSC101质粒，尽管这种情况很少。这个质粒受到复制子的严谨性控制，因此它的拷贝数很低（<5拷贝/细胞）。对于某种基因或者蛋白产物过量对细胞产生有害作用这种情况，可以考虑选择具有该复制子的质粒。可以选择的是，共表达载体通过克隆两个基因在同一个质粒上，可以简化双表达。共表达载体拥有两个多克隆位点，每个多克隆位点都有一个T7启动子，一个lac启动子和一个核糖体结合位点。通过使用不同的兼容的共表达载体，4个表达载体可以得到八种重组蛋白。启动子毫无疑问，在原核启动子研究中最主要的lac启动子。Lac