PCR和测序 王海阔.pptxVIP

PCR扩增和测序简介 分子病理学部 王海阔 一、几种常用PCR 二、一代二代测序 一、几种常用PCR ·常规PCR：聚合酶链式反应，看作是生物体外的特殊DNA复制 ·巢式PCR：两套引物扩增两遍 ·降落PCR：每循环降低退火温度 ·热启动Hot-Start PCR：使用热启动酶和石蜡油包埋 80℃ ·多重PCR：许多引物在一个反应管同时扩增 ·逆转录RT-PCR：mRNA cDNA ·实时RT-PCR：实时在线监控反应过程 ·荧光Q-PCR：荧光对PCR产物进行标记 ·其余还有梯度PCR，免疫PCR，原位PCR，数字PCR，长距离 PCR等30多种 实时荧光定量PCR MLPA 多重链接探针扩增技术 一、几种常用PCR PCR实验流程： 预变性 变性 退火 循环 延伸 总延伸 保存 一、几种常用PCR 一、几种常用PCR Q-PCR实验流程： UDG孵化 预变性 变性 循环 退火/延伸 熔解曲线 一、几种常用PCR 一、几种常用PCR MLPA实验流程： 标本制备 稀释 变性 杂交 连接 扩增 变性 毛细管电泳 数据分离 PCR扩增 Taq酶 TQA测序酶 一对 FR 单向 F/R dNTP dNTP ddNTP 量少 要求质量高 单一条带 片段 相差1bp 指数 2n 线性 Sanger测序 二、一代二代测序 对比 聚合酶 引物 底物 模板 产物 反应 二、一代二代测序 Diagram PCR扩增 核酸提取 产物纯化 测序扩增 变性上机 纯化 峰图分析 Sanger测序 二、一代二代测序 Sanger测序法，又叫双脱氧链末端终止法 二、一代二代测序 Diagram DNA片段化 gDNA 末端修复 3‘加A 5’磷酸化 +index标记 加接头 PCR扩增 互补杂交 连接 磁珠抓取 变性 片段分析 洗脱 Pooling 上机测序 生物素探针 建库 捕获 三、其他 常用纯化方法： 1.柱纯化：加结合液，混匀移入吸附柱，离心，清洗液洗涤2次，晾干，洗脱 2.酒精沉降：沉降，离心吸附，70%乙醇清洗2次，晾干，溶解 3.酶消化：加入SAP-ExoⅠ （虾碱磷酸酶＋核酸外切酶1）酶混合液，适温酶消化，升温终止反应 4.磁珠纯化：细胞裂解，酶处理，核酸与其他生物大分子物质分离，核酸纯化，晾干，洗脱 5.切胶回收：电泳后在紫外灯下切目的带，溶胶，清洗，晾干，洗脱 细心认真，操作规范，防止污染！ 谢谢！