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图10：小提质粒 1-3：不同单克隆 4： EcoRλ14 marker 5-8：不同单克隆 1 3 2 4 6 5 7 8 图11：BamHI/XhoI酶切验证 1-7．不同单克隆酶切 8. DL2000 marker 1 2 3 4 5 6 7 8 736bp → 预期实验结果与讨论 思考题： 质粒电泳为什么有多条带？ 图11未切出片段可能原因？ 图12：EcoRI单酶切阳性结果 1-2. 单克隆1酶切 3-4. 单克隆3酶切 5. DL2000 marker 1 2 3 4 5 245bp → 预期实验结果与讨论 ←736bp 1 2 3 图13：酶切验证非突变体质粒 DL2000 marker EcoRI单酶切pc3.1-CDS BamHI与XhoI双酶切pc3.1-CDS PCR法突变质粒构建 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 标准的PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 　　　　 　各10～100pmol 模板DNA 　　　 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 引物设计： （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 3’ 5’ 3’ 5’ 限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCR反应条件 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+