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PCR法鉴定T-DNA插入突变体1
PCR法鉴定T-DNA插入突变体T-DNA插入T-DNA，转移DNA（transferred DNA)是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组将目的基因转入到经过改造的T-DNA区，借农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株除用于转基因以外，T-DNA插入到植物基因中能引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。鉴定原理BP: T-DNA载体上的插入片段的左边界序列 通用引物（LB）LP、RP: 用已知的被插入的基因的侧翼序列设计的特异性引物鉴定原理WT 没有插入HZ杂合体HM 纯合体鉴定原理ExonIntronUTRpromoter本次实验材料：插入位点1100 bp500 bp实验安排实验安排提取植物基因组每2个人一个小组，每小组提 1 个样品每行一个大组，另提1个对照WT注意写好样品编号实验安排提取植物基因组（1）剪取约0.5-1 cm2大小的幼嫩植物叶片，放入离心管中；（2）在液氮中，用研磨棒将叶片磨碎；（3）研磨结束后，向管中加入400 uL的提取缓冲液，混匀；（4）室温，12000 rpm离心3 min；（5）吸取300 uL上清液至一新的离心管中，加入300 uL异丙醇，混匀；（6）室温，12000 rpm离心5 min；（7）倒掉上清，加入300 uL 70%乙醇；（8）室温，12000 rpm离心3 min；（9）倒掉上清，待管中液体晾干后，加入50 uL ddH2O溶解。实验安排PCR反应鉴定每小组做 1 管PCR反应( LP+RP+LB ) 注意写好样品编号实验安排PCR反应鉴定成 分 用 量 ( ul )primers0.5+0.5 +0.52X Taq Mix10ddH2O6template3total20Mix 17 ul 94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃ 16℃ 3min 30s 30s 1:00 10:00∞ 32 cyclesMix 1: LP+RPMix2: LB+RP 电泳检测
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