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第四章 蛋白质的稳定性和稳定化 生命科学学院: 柯德森 Desenke@21 QQ270820679 研究意义: 了解蛋白质稳定性与结构的关系是理解蛋白质分子自我装配过程的关键. 研究蛋白质稳定性机制是实现酶工程研究目标的重要基础. 第一节: 蛋白质的稳定性 一. 蛋白质稳定性的分子原因 蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力. 蛋白质的特定功能是由其特定的空间结构决定的,要保持其生物活力,必须保持其空间结构,稳定蛋白质空间结构的因素是什么? 理解蛋白质 稳定性的概念? 维持蛋白结构稳定的主要因素: 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分子质量配体的结合作用 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 盐桥和氢键 二硫键 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 氨基酸残基的坚实装配 疏水相互作用(思考题) 疏水性标尺 疏水性氨基酸越多越稳定? 疏水性与蛋白质稳定性的关系小结 疏水性大小与稳定性没有必然的联系 非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排列是稳定性的原因之一 增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:降低蛋白质表面的疏水性,增加蛋白质内部的疏水性 二. 测定蛋白质稳定性的方法 比较蛋白质稳定性的准则包括: 熔化温度Tm;蛋白质伸展一半时的变性剂浓度 蛋白质自由能; 最大稳定性温度(Ts); 在特定温度下蛋白质功能活性维持时间. 思考 熔化温度Tm和蛋白质伸展50%时的变性剂浓度是预测酶稳定性的最有用参数; Tm: 蛋白质受热伸展过渡中点时的温度; 变性剂浓度: 蛋白质加变性剂伸展过程中使蛋白质伸展一半时所需要的变性剂浓度; 蛋白质失活的原因和机理 蛋白质水解酶和自溶作用 聚合作用: 蛋白质首先发生可逆性伸展,伸展的蛋白质分子彼此缔合,以最大限度减少疏水氨基酸暴露于水溶剂,最后可能发生蛋白质分子间二硫键的形成,从而使蛋白质沉淀析出.蛋白质的聚合作用可能是不可逆的,并不一定是不可逆的. 思考 聚合如果发生共价键就是不可逆的? 极端pH: 活性中心氨基酸必需基团电离. pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活. 氧化作用: 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧、H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。 表面活性剂和去污剂 表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用,导致蛋白质不可逆变性.其中阴离子去污剂的作用比阳离子和非离子去污剂强烈. 变性剂： 脲和盐酸胍:机制尚不明确,可能是消除了维持三级结构的疏水作用力或直接与蛋白质分子作用. 高浓度盐：高浓度盐既有稳定作用也有变性作用，这要看盐的性质和浓度。 螯合：常常不可逆地失活需要金属辅因子的酶，但可稳定不需要金属辅因子的酶； 有机溶剂：改变溶液的介电常数;增加疏水核的溶解度,降低带电表面的溶解度;夺去酶分子表面的必需水而使酶失活. 重金属离子和巯基试剂: 与蛋白质的巯基、二硫键以及色氨酸、组氨酸残基反应。 热:热失活是工业上最经常遇到的酶失活的原因.热失活也分二步过程:伸展---不可逆失活. 机械力： 振动、剪切、超声波、压力都可能引起蛋白质的变性，这种变性理论上是可逆的，但也可能伴随着其他反应而不可逆地失活。 冷冻和脱水： 冷冻和脱水时，溶质被浓缩，引起酶微环境中pH和离子强度的剧烈改变，减弱疏水相互作用,并可能引起二硫交换和巯基的氧化。 辐射作用: 辐射可产生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或间接地作用于蛋白质分子. 第三节 蛋白质的稳定化 一是如何防止蛋白质的可逆伸展，可以开发出普遍适用的方法； 二是一旦酶发生了可逆伸展，如何防止其不可逆失活反应的发生，对此针对不同的失活原因采取不同的特殊稳定化方法。 一. 固定化： 固定化稳定酶的因素：空间障碍、机械方式的空间限制。 空间障碍：由于空间障碍可以防止蛋白水解酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶。 机械方式: 使酶发生交联或包埋在载体紧密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡。 空间限制引起的 表观稳定性 非共价修饰 反相胶束 添加剂:专一性底物及配体;非专一性中性盐和多羟基物质;与失活剂竞争的物质;除掉破坏化学催化剂的物质 蛋白质间非共价相连 化学修饰： 修饰作用可达到稳定酶的作用，得到可溶性稳定化酶。 可溶性大分子修饰酶： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、肝素等。 小分子修饰酶 原因： 修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定的构象； 修饰关键功能基团也会达到稳定化； 由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基有可能形成附加氢键或盐键； 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相互作用； 蛋白质表面基团的亲水性； 交联酶晶体