研究生实验设计(精选).docVIP

研究生分子生物学实验设计 概述 异基因造血干细胞移植是白血病治疗主要方法之一，复发和移植物抗宿主病（graft-versus-host disease GVHD）是阻碍其发展主要原因graft-versus-leukemia GVL 与移植物抗宿主病（graft-versus-host disease GVHD），而HA-1、2、5，HB-1，仅局限性表达于造血起源细胞，不产生或产生轻度GVHD，以诱导GVL效应为主，是分离GVL和GVHD的理想靶抗原。HA-1，2均是HLA-A2限制性mHAg，且均不与HLA连锁，只在造血细胞起源的细胞 如:纯化的T-细胞,B-细胞,单核细胞及未成熟的胸腺细胞 表面发现，在上皮起源的纤维母细胞,角质形成细胞,黑色素细胞以及内皮细胞等细胞表面则不能检测到。 HA-1由常染色体基因KIAA0223基因 HA-1R编码VLRDDLLEA 和其等位基因 HA-1H编码HVLHDDLLEA 编码. HA-2基因序列与肌浆球蛋白Ⅱ类基因的序列有同源性。Koosterboer[4]研究显示接受DLI治疗的白血病患者CTLs的3－35％为HA-1/HA-2特异性CTL，此克隆在总的白血病反应性T细胞中表现出免疫优势。HA-1H蛋白（一种mHag），刺激HA-1H阴性供者外周血单个核细胞，产生特异性杀伤HA-1H阳性白血病细胞的CTL。诸多研究表明，以mHags为靶抗原的免疫治疗可有效杀伤白血病细胞[2,3]。 本研究在既往研究的基础上以造血起源细胞的mHags （HA-1，2）作为疫苗靶标，建立重组DNA，以免疫白血病模型小鼠，检测是否有特异性杀伤白血病细胞的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）产生，同时探讨是否可激活体液免疫，诱导特异性抗体的产生。 文献 Etto TL, Stewart LA and Nguyen TH, et al.Expression and purification of the minor histocompatibility antigen, HA-1H generated in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2007 ,54 1 :176-182 Griffioen M, van der Meijden ED and Slager EH, et al.Identification of phosphatidylinositol 4-kinase type II beta as HLA class II-restricted target in graft versus leukemia reactivity. Proc Natl Acad Sci U S A.2008，3 [Epub ahead of print] Etto TL, Stewart LA and Muirhead J, et al. Kappa immunoglobulin light chain polymorphisms and survival after allogeneic transplantation for B-cell malignancies: a potential graft-vs-leukaemia target. Tissue Antigens. 2007,69 1 :56-61 Kloosterboer FM, van Luxemburg-Heijs SA, van Soest RA, et al. Direct cloning of leukemia-reactive T cells from patients treated with donor lymphocyte infusion shows a relative dominance of hematopoiesis-restricted minor histocompatibility antigen HA-1 and HA-2 specific T cells. Leukemia. 2004,18 4 :798-808 基本内容 使用一个载体，表达两个基因 一个报道基因（如GFP） 一个HA -1基因 HA-1上加入可用于纯化的外源性抗原表位 epitope， 如FLAG或His-tag 基本要求 开放性设计，没有统一方案 允许使用商业性试剂盒、载体 以四人为一组，以小组为单位，独立设计，独立完成 设计方案书面呈交 技术细节要有描述，不能过于笼统 奖励创意，鄙视抄袭 技术步骤 基因克隆 HA基因需要融合一段FLAG-或His-epitope 基因表达载体（包括启动子）选择 导入DNA到细胞内 表达检测 考核 递交书面报告2页，其