原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
EMSA
EMSA总步骤
一、核蛋白的提取：
准备物品:
蔗糖、Tris、KCl、NaCl、EDTA、EGTA、DTT、glycerol、spermidine、PMSF、leupeptin、pepstatin、aprotinin、benzamidine、NaF、Na3VO4均购自sigma公司。透析管（Slide-A-Lyzer?，10,000 MWCO）购自PIERCE公司。Dounce(tight)匀浆器购自Wheaton公司。
终浓度和分子量 作用 储存位置状态 配制注意事项 spermidine 0.5 mM FW 145.2 在任何pH值都带正电，使膜、核酸结构稳定。 DTT 1mM FW 154.3 Reductant of other disulfides. PMSF 0.5mM MW 174.2 Inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase,such as chymotrypsin, trypsin, thrombin and thiol proteases such as papain. leupeptin 20μg/ml FW 475.6 Reversible competitive inhibitor of serine and thiol proteases.Reported to inhibit calpain, cathepsin B, cathepsins H and L and trypsin. pepstain 0.76μg/ml FW 685.9 inhibitor of acid proteases (aspartyl peptidases). aprotinin 2μM FW 6500 Competitive serine protease inhibitor. Benzamidine ? 1mM FW 156.6 Reversible inhibitor of trypsin, trypsin-like enzymes, and serine proteases. NaF 50mM MW 41.99 Inhibitor of serine/threonine phosphatases. Na3VO4 1mM MW 183.91 Inhibits ATPase, alkaline phosphatase and tyrosine phosphatase.
3. Buffer C
20mM HEPES pH7.9、25% glycerol、1.5mM MgCl2、1mM EDTA pH8.0
Filter sterilize stock solution
使用前加入以下浓度的试剂：
名称 终浓度 DTT 1mM PMSF 0.5mM leupeptin 20μg/ml pepstain 0.76μg/ml aprotinin 10μM Benzamidine 1mM NaF 50mM Na3VO4 1mM 4. Dialysis Buffer
10mM Tris pH7.9、10% glycerol、5mM MgCl2、50mM KCl、1mM EDTA pH8.0
Filter sterilize stock solution
使用前加入以下浓度的试剂：
名称 终浓度 DTT 1mM PMSF 1mM Benzamidine 1mM NaF 50mM Na3VO4 1mM
具体步骤：
1. 冰上吸去细胞培养基；
2. 加入冷的PBS 10ml/10cm plate。
3. 吸去PBS, 加HB 1ml/10cm plate, 冰上静置10min, 刮下细胞至1.5ml EP管。
4. 3000rpm, 4℃, 5min。
5. 弃上清，0.25ml HB 重悬离心下来的细胞，将各相同处理组合并至 1ml/管，因为此实验中使用的匀浆器每次的容量为 1ml, 所以为了方便重悬细胞的HB的体积可稍有变动。
6. 使用匀浆器（Dounce Homogenizer-紧）匀化细胞，每个处理为 1ml, 匀浆15次。
7. 将细胞匀浆转移至另一1.5ml EP管。
8. 分离细胞核：14000g, 4℃, 15sec (指达到最高速度后的时间)，弃上清 。
9. 解离转录因子：用约20μl Buffer C 重悬离心下来的细胞核，用手指轻弹EP管底部 混匀 ，然后加入约20μl 1M KCl－用手指轻弹EP管底部 混匀 。Buffer C与1M KCl的总量应与细胞核的体积相同，Buffer C ：1M KCl ＝
文档评论（0）