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（一）酵母杂交系统 （四）DNA与蛋白质互作的免疫沉淀分析 ? 菌落杂交 . 需要3条寡核苷酸引物(包括两条外侧正向和反向引物以及内部突变引物)和两轮PCR循环， 模板通常是克隆到载体中的待诱变的野生型目的片段。 步骤： 1）先由突变引物(M)和相应的外侧引物(R1)引发第1轮PCR扩增， 2）PCR产物作为引物与另一外侧引物(F2)用于第2轮PCR反应，扩增出含突变位点的终产物。 2、大引物PCR定点诱变技术 P92 五、DNA与蛋白质互作分析 酵母双杂交体系（ Yeast two－hybrid system）：也叫相互作用陷阱（interaction trap），是20世纪90年代初发展起来的分离新基因的新方法，可用于分离能与靶蛋白相互作用的基因，也是直接在细胞内检测蛋白－蛋白交互作用的灵敏度很高的遗传学新工具。 1.酵母双杂交系统 酵母双杂交体系的原理 研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成。如GAL4（GAL4蛋白是酿酒酵母的转录调节因子之一）有两个结构域（domain），即BD和AD（转录激活因子发挥功能所必需的 ）。一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。 GAL4这两个结构域分开时仍分别具有功能，但单独的BD或AD都不能启动下游报告基因转录，只有将这两部分通过适当途径连在一起后才能恢复激活转录的活性。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。 主要有二类载体：含BD的载体和含AD的载体。 2.酵母单杂交法 酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用。 酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。 原理：将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。 凝胶阻滞试验（gel retardation assay）：又叫DNA迁移率变动试验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 原理：在凝胶电泳中没有结合蛋白质的DNA片段迁移快，而与蛋白质结合形成复合物后由于受到阻滞而迁移得慢。试验中，当特定的DNA片段与细胞提取物混合后，若该复合物在凝胶中电泳中的迁移率变小说明该可能与提取物中某个蛋白分子发生了相互作用。 （二）凝胶阻滞试验 P186 主要步骤：① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；③ 加入适量DNaseI使DNA链发生断裂。（DNaseI的用量非常关键，要保证一条DNA链只发生一次断裂！）④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；⑤进行DNA凝胶分析。?? （三）DNase I 足迹试验 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。 1.与蛋白质特异结合的DNA免疫沉淀分析 主要步骤：① 提取目标总DNA RE消化成特定末端片段 接上特定接头② 与特定转录因子原核或真核表达的融合蛋白质温育；③ 利用标签蛋白检出融合蛋白，再用沉淀法分离复合物，与转录因子结合的DNA片段被免疫共沉淀；④释放结合的DNA，用根据接头设计的引物PCR扩增该DNA⑤测序、分析转录因子控制的下游效应基因。?? 染色质免疫沉淀分析（chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种研究体内DNA-蛋白质相互作用的理想方法，相对于传统的其它研究蛋白与DNA相互作用的方法（如EMSA,由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况），ChIP技术能更加真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。 2.?染色质免疫沉淀技术 基本原理:是在活细胞状态下固定蛋白质－DN