端粒酶RNA反义核酸对宫颈癌Hela细胞生长抑制作用.docVIP

端粒酶RNA反义核酸对宫颈癌Hela细胞生长抑制作用 　　摘要：目的：探讨端粒酶RNA反义核酸对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及其机理。方法：对我院收治的100例宫颈癌患者资料进行分析，患者入院后均得到确诊，并将其设置为正义核酸组、反义核酸组，每组有患者50例，设置50例同期入院宫颈癌患者为对照组。采用四甲基偶氮错蓝法、、PCR-端粒重复序列扩增（TRAP）-酶联免疫吸附实验（ELISA）、吖啶橙染色法、流式细胞术对患者Hela细胞转染反义核酸进行检测，分析端粒酶RNA反义核酸对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用。结果：hTR组浓度为0.05时，反义核酸浓度、0.1浓度时反义核酸浓度、0.2浓度时反义核酸浓度，显著低于正义核酸组（Plt;0.05）;hTR组浓度为0.05时反义核酸浓度、0.1浓度时反义核酸浓度、0.2浓度时反义核酸为，显著高于正义核酸组（Plt;0.05）;hTR组细胞转染反义核酸1天细胞凋亡率变化、2天细胞转染反义核酸1天细胞凋亡率变化、3天细胞转染反义核酸1天细胞凋亡率变化，显著低于正义核酸组（Plt;0.05）。结论：端粒酶反义核酸能够通过特异性有效的抑制端粒酶活性，诱导细胞凋亡，增强细胞周期阻滞等多种途径抑制宫颈癌Hela细胞生长。 　　关键词：端粒酶RNA反义核酸;宫颈癌Hela细胞;抑制作用;机理 　　宫颈癌是临床上常见的疾病，这种疾病发病率较高，且随着人们生活节奏的加快其发病率出现上升趋势。患者发病后临床上主要表现为：阴道流血、阴道排液等，影响患者生活质量[1]。目前，临床上对于宫颈癌尚缺乏理想的治疗方法，常规方法虽然能够改善患者症状，但是长期疗效欠佳，治疗预后较差。根据相关研究结果显示：端粒酶RNA（hTR）模板区及端粒酶RNA催化亚单位（hTERT）区的反义核酸，具有序列特异性，能够明显抑制宫颈癌细胞端粒酶活性，抑制细胞的生长。因此，临床上研究端粒酶RNA反义核酸对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用具有重要意义[2]。为了探讨端粒酶RNA反义核酸对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及其机理。对2013年4月至2014年4月我院收治的100例宫颈癌患者资料进行分析，报告如下。 　　1.资料与方法 　　 1.1一般资料 　　 对我院收治的100例宫颈癌患者资料进行分析，并将其设置为正义核酸组、反义核酸组，每组有患者50例，正义核酸组患者年龄为（36～68）岁，平均年龄为（52.8±0.3）岁，患者从发病到治疗时间为（1～7）月，平均时间为（3.1±0.6）月;反义核酸组患者年龄为（38～66）岁，平均年龄为（51.3±1.1）岁，患者从发病到治疗时间为（1～8）月，平均时间为（4±1.0）月。设置50例同期入院宫颈癌患者为对照组，患者年龄为（35～69）岁，平均年龄为（52.4±0.9）岁，患者从发病到治疗时间为（1.2～8.7）月，平均时间为（4.3±1.7）月。患者对治疗方案、护理措施等有知情权，患者年龄、病程等差异不显著（Pgt;0.05），具有可比性。 　　 1.2方法 　　 采用四甲基偶氮错蓝法、、PCR-端粒重复序列扩增（TRAP）-酶联免疫吸附实验（ELISA）、吖啶橙染色法、流式细胞术对患者Hela细胞转染反义核酸进行检测，宫颈癌Hela细胞在含有10%新生牛血清的RPMI-1640培养基中，培养温度控制在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行常规培养，取对数生长期细胞用于转染。每次试验均重复三次。MTT法测反义酸对细胞生长的作用。将细胞接种在96孔板上，分别在转染后的1，2，3，4，5天后，采用MTT法测定细胞存活率，并且测定波长为490、630nm时的吸光度（A）值，并且计算其差值，细胞生长抑制率的计算方法为[（A对照组-A实验组）/A对照组]×100%。端粒酶活性检测：分别收集转染后1，2，3天的细胞，根据TRAP试剂盒提供的方法进行检测，并且将实验组Hela细胞的端粒酶活性设置为，将裂解缓冲液作为阴性对照，在酶标仪上测定波长450，690nm的A值，根据以下公式计算实验组相对端粒酶活性。实验组相对端粒酶活性（A实验组-A阴性对照组，对于Agt;0.20判断为阳性）。同时，取20ulPCR产物 ，经过12%非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，阳性结果表现为凝胶上出现相差6个核苷酸的DNA条带[3]。细胞形态学观察：将10mg吖啶橙溶解在100mlPH值为6.8的磷酸盐缓冲液（PBS中），并且将其保存着在温度为4℃下并避光保存。取转染后3天的各组细胞，制备成1×07个/ml的细胞悬液;吸取95ul细胞悬液，加入5ul吖啶橙液充分混匀;吸入1滴混合液在洁净玻片上，并将其覆盖、封片，采用显微镜进行观察。细胞凋亡的测定：将转染后3天的细胞进行离心，并采用PBS进行两次