丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备讲解.pptVIP

注意事项 1 安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 2 用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 3 样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。 4 加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。 * 5 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)。 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液? * 项目四 丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备 姓名：吴彩霞 班级：生药1313 组别：第1组 学号：2013040930 指导老师：彭加平 韦平和 王芳 背景知识 丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）在自然界中普遍存在，它的生理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换。 SHMT的催化反应是氨基酸和核酸代谢的连接点，在氨基酸的工业生产和植物的光呼吸过程中，SHMT也是一个关键酶。 L-丝氨酸是氨基酸输液的重要成分,化妆品的添加剂,酶法生产色氨酸的前体物质。L-丝氨酸在体内代谢速度极快.因此,直接发酵生产很困难. 酶法合成L-丝氨酸由于利用甘氨酸和甲醛特异的合成L-丝氨酸,具有原料来源方便,原料成本低和可合成高浓度产品等优点,因此是最有前景的L-丝氨酸生产方法. * * 1、电泳是指带电颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动。 2、这种特性，用电泳的方法对这些物质进行定性及定量分析，也可用于混合物的分离 3、凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法 * 按分离原理：区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4种 区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液中 分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。 区带电泳分类： 按支持物物理性状分类 1. 滤纸及其他纤维素膜电泳。 2. 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 3. 凝胶电泳，如琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4. 丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。 按支持物的装置形式不同分类 1. 平板式电泳 2. 垂直板式电泳。 3. 连续流动电泳 按pH的连续性不同分类 1. 连续pH电泳：电泳全部过程中缓冲液pH保持不变。 2、不连续pH电泳 电泳技术的分类 * 凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行 所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术 SDS—PAGE电泳可用圆盘和垂直平板电泳的形式，原理相同，步骤也大致相同。 SDS—PAGE电泳亦分为不连续系统和连续系统。 本实验采用垂直平板以不连续系统的SDS—聚丙烯酰胺凝胶方式进行电泳。 垂直平板电泳的优点在于在一块凝胶平板上可以同时进行不同样品的电泳。因此条件一致，更加便于比较。 * 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳 这种凝胶由丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N′-甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺（N，N′-methylene-bis-acrylamide，简称Bis)聚合而成。 PAGE电泳是根据蛋白质分子（或其它生物大分子）所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，无电渗作用，设备简单，用样量少（1-100μg）和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测定蛋白质亚基分子量。 * 三、实验原理 1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 2、蛋白质分子是两性电解质，pHpI时该蛋白质带负电荷，反之pHpI时该蛋白质带正电荷。 3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子