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RNA干涉转基因马铃薯对卷叶病毒抗性的研究 　　摘要：利用大田统计方法，结合分子生物学手段和生物信息学手段对转化的23个转基因马铃薯突变株进行抗病性鉴定，分析转化群体中外源基因的插入信息，并利用双夹心抗体酶联免疫法技术研究受侵染后马铃薯卷叶病毒基因在这些转化体中的表达情况。结果表明，一些株系出现了性状突变，通过分子生物手段检测发现大部分株系都有一定的马铃薯卷叶病毒抗性，但是抗性水平差异很大。试验验证了RNA干涉技术策略的可行性。 　　关键词：马铃薯卷叶病毒； RNA干涉（RNAi）； 酶联免疫检测 　　中图分类号：S432.4+1；S532 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-1994-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.020 　　Abstract： The field statistical method combined with molecular biology and bioinformatics methods were used to identify potato disease resistance of 23 transgene mutant strains， analyzing the transformation groups’s external gene whose inserted information. And the double-direct sandwich ELISA technique was used to study infested potato leaf roll virus gene expression in the transformation of the body. The results showed that some character mutation strain appeared， most of the strains measured by the molecular biological tools had some potato leaf roll virus resistance， but the resistance level difference was big. 　　Key words： potato leaf roll virus（PLRV）； RNA interference（RNAi）； enzyme-linked immune detection 　　马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）属黄化病毒组，由蚜虫以持久方式传播，是马铃薯上最重要的病毒病害之一[1]。马铃薯卷叶病毒可侵染马铃薯引起卷叶、黄化、矮缩、僵化及块茎网状坏死等症状，严重影响马铃薯的产量和品质，是一种世界范围的马铃薯重要病害[2-5]。 　　RNAi是由dsRNA介导的基因沉默现象，是细胞内的一种防御机制，可特异地降解细胞内与之具有同源性的核酸[6]，起到调节细胞内编码基因表达的作用。由于RNAi具有抗病毒表现型为高抗或近似于免疫、抗病性更持久、生物安全性高等优点，具有更加广阔的应用前景[7-10]。因此，探讨利用RNA介导抗性来培育抗病毒转基因马铃薯的这一新策略的可行性和应用价值具有重要的现实意义。 　　本试验利用大田统计方法结合分子生物学手段和生物信息学手段对青海大学农牧学院实验室转化的23个转基因马铃薯突变株进行抗病性鉴定，整个试验以验证RNA干涉技术策略的可行性，为得到对马铃薯卷叶病毒具有稳定抗性的马铃薯转基因植株提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　试验材料为青海大学农牧学院实验室转化的23个转基因马铃薯突变株和未转基因对照高原4号和脱毒175以及感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯植株PLRV-2、PLRV-4、PLRV-8（表1）。所转入的基因为RNA干涉片段，根据马铃薯卷叶病毒基因开放阅读框设计引物扩增出2个片段，分别命名为PLRV1和PLRV2，大小分别为240 bp和400 bp。通过正向方向插入载体PCADS1341中，再通过根癌农杆菌转入马铃薯植株，通过验证获得转基因材料。 　　1.2 主要试剂及仪器 　　主要试剂有十六烷基-三甲基-溴化胺（CTAB）（上海博奥生物科技公司）、PCR试剂（10×Buffer、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/μL Taq聚合酶）（Takara）、琼脂糖（Agarose）（Biowest）、Marker2000（Takara）、ELISA试剂盒（Cygnus）。TE（pH 8.0）：分别量取2 mL 1 mol/L的T