实验五色谱法汇编.ppt

色 谱 法 （Chromatography） 色谱分析法（简称色谱法或层析法） 色谱分析法简称色谱法或层析法。1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3放在竖立的玻璃柱中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在柱的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相，冲洗剂称为流动相。现在的色谱法不仅可分离有色物质，还可分离无色物质，不局限于“色”的意义。 分离原理 色谱法就是利用混合物中各组分在固定相和移动相中进行反复的吸附或分配作用，达到各组分分开的目的。 分 类 按照被分离物质在固定相中的作用原理不同，色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱等。 按照操作方式不同，又可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱、和高效液相色谱等。 本次实验内容 1、柱层析 2、纸层析 一、柱色谱 将固定相装于柱管内构成色谱柱，色谱过程在色谱柱内进行。按色谱柱的粗细差别，可分为填充柱色谱法、毛细管柱色谱法及微填充柱色谱法等。 实验目的 1. 掌握柱色谱的原理和基本操作。 2. 利用柱色谱的方法分离和提纯有机物。 实验原理 柱色谱是利用混合物中各组分受吸附作用的不同以及各组分在溶剂中溶解度的差别，将各组分分离。可分为吸附柱层析和分配柱层析。 吸附柱层析 预分离的混合物随着流动相通过色谱柱，在固定相上反复发生吸附－洗脱－再吸附－再洗脱。由于各组分吸附能力不同，经过一段时间，按对吸附剂亲和力大小，形成不同色带而分离。 影响因素 吸附剂 柱色谱常用的吸附剂是氧化铝和硅胶。吸附剂应进行纯化和活化处理。 物质的结构和吸附能力 吸附性与分子极性成正比。 洗脱剂 先用极性小的溶剂洗脱，后改用极性强的溶剂洗脱。使化合物按极性与小道大顺序出柱。 仪器和药品 色谱柱、玻璃漏斗、滴液漏斗、100ml烧杯一个、150ml锥形瓶二个、滴定台（或铁架台）、剪刀、玻棒 0.05%甲基橙和0.25%亚甲基蓝混合乙醇溶液[1]、 100～200目中性色谱用氧化铝、无水乙醇、0.1mol/L盐酸溶液、蒸馏水、脱脂棉、滤纸 [1] 称取110mg甲基橙和550mg亚甲基蓝于250ml 95%乙醇中溶解。 实验步骤 1、装柱 取清洁干燥的色谱柱，管底垫少许棉花。倾入无水乙醇20ml，称取8g柱用氧化铝，经漏斗缓慢倒入管中，同时轻轻拍打色谱柱，用无水乙醇清洗沾在管内壁上的氧化铝。打开活塞，氧化铝随着溶剂流动继续下沉，直至沉降停止。 在氧化铝表面平整紧贴地覆盖一张略小于色谱柱内径的滤纸，打开活塞使氧化铝表面仅留一薄层的溶剂 1-2mm 。 实验步骤 2、加样 在色谱柱表面小心加入样品溶液0.5亳升（注意勿使样品沾在色谱柱的内壁上）。 实验步骤 3、洗脱 打开活塞，使样品液全部进入吸附剂（勿使流干）。加入无水乙醇0.5ml，打开活塞使蓝色谱带完全进入吸附剂，关闭活塞；重复二次，蓝色谱带逐渐下移。继续加无水乙醇，使亚甲基蓝完全洗脱，收集于第1个三角锥瓶。改用25g/LNaOH溶液作洗脱剂（操作步骤与以无水乙醇作洗脱剂相同），使甲基橙完全洗脱，收集于第2个三角锥瓶。 思考题 1．装柱过程应注意什么事项？ 2．加样、洗脱过程应注意什么事项？ 二、纸色谱 纸色谱为分配色谱，色谱过程在固定相构成的平面状层下进行。滤纸为载体，固定相为滤纸上的水，流动相（展开剂）为用水饱和过的有机溶剂。 实验目的 1、掌握纸层析分离氨基酸的方法。 2、掌握纸层析基本原理。 实验原理 纸色谱属于分配色谱。 衡量物质向上移动的物理量是比移值（Rf） 例:大黄中游离蒽醌的纸色谱图 溶剂前沿 大黄素甲醚 芦荟大黄素 大黄素 大黄酸 点样点 仪器和药品 干燥大试管及配套软木塞、喷雾器、电热吹风器、刻度尺（20cm）、滤纸条（长160mm，宽15mm）、铅笔、木框（22×40cm）、大头针、毛细管长6~7cm、棉线 氨基酸混合液、饱和苯酚水溶液、0.2%茚三酮乙醇溶液 实验步骤 1．在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小孔。 2．将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸下端1cm处用铅笔轻画一横线，并在横线的中央画一直径为2mm的小圆圈。 3．用毛细管吸取氨基酸混合液，在滤纸条下端的小圆圈内点样。 实验步骤 4. 取干燥大试管，加入被水饱和的酚溶液10ml，注意勿使溶液沾到试管壁上，将试管垂直固定。 5. 在距滤纸条下端0.5cm处穿大头针。从滤纸条上端小孔处穿棉线并左右分开，调节线的高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液0.5cm，注意勿使点样点浸入溶液中，亦勿使滤纸条接触试管壁。 实验步骤 6. 此时即可看到溶剂向上移动，溶剂升到一定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶剂上升的前沿。 7. 将滤纸条两