实验10-PCR反应讲稿.pptVIP

聚合酶链式反应（PCR） 掌握PCR的基本原理； 了解PCR的基本操作技术 一、实验目的 实验安排： 1、PCR实验操作。 2、实验原理。 3、制作检测电泳凝胶：1%TAE琼脂糖凝胶。 4、检测实验结果。 1、PCR反应混合液的制备（25 μl 实验体系） DNA模板（20ng/ μl） 1μl 10x Taq PCR buffer 2.5 μl dNTP（10mM） 0.5μl 引物 FP（10 μM） 0.5μl 引物 RP（10 μM） 0.5μl Taq 酶（5U/μl） 0.5μl ddH2O 19.5μl (补齐到25 μl ) 混匀，放入PCR仪中开始反应 PCR实验操作（所有操作均在冰上进行） 本实验中，已预制除模板外的其他反应体系混合液（mix），每小组取48 μl mix平均分成2份：一份加1μl DNA质粒模板，另一份加1μl ddH2O，用移液器轻轻吹吸几次混匀，置mini离心机上瞬离，做好标记后置于PCR仪中扩增。 （注意：所有操作均在冰上进行！！） 每组的模板和水非一次性，要回收给下一班用 2、PCR反应程序设计如下 94 ℃，预变性5min 94 ℃，变性30s 55 ℃，退火30s 30个循环 72 ℃，延伸15s 72 ℃，延伸10min 多聚酶链式反应是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。与体内DNA复制过程相似。 由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增 二、实验原理 1、变性（94℃） ： 使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链DNA 2、退火（55℃）： 引物和其互补的模板在局部形成杂交链 3、延伸（72℃）： 通过Taq DNA聚合酶使4种单核苷酸从引物的3`端开始掺入，沿模板从5`向3`端方向延伸，合成与模板DNA的互补链。 实验原理 实验原理 以上3步为一个循环，每一循环的产物可作为下一个循环的模板，反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA片段经20次循环扩增后可达106。 双链DNA分子 双链断开 循环1 模板与引物结合 循环1 Taq Taq 循环1 Taq Taq 循环1 循环1 双链断开 循环2 模板与引物结合 循环2 Taq Taq Taq Taq 循环2 94℃变性 双链断开 循环3 循环3 Taq Taq Taq Taq Taq Taq Taq Taq 循环3 循环n 所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染（灭菌） 所有PCR试剂中用的水都应该是最高质量的双蒸水 所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满足然后再分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性 PCR管和枪头都一次性使用 PCR中需注意事项 3、制作检测电泳凝胶：1% TAE琼脂糖凝胶 4、琼脂糖凝胶电泳检测实验结果： 样品 5 ul + loading buffer 1ul 电压：160v，15-20min。