基因重组及遗传分析重点.ppt

CRISPR结构及作用机理 CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeat 为规律成簇间隔短回文重复，是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。CRISPR通过与一系列相关蛋白、前导序列一起，为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。 这种结构最早于1987年在大肠杆菌 Escherichia coli K12的iap基因侧翼序列中被发现，后来，科学家利用这个小片段找到了一种操作简单、可对多种生物的基因组进行遗传改造的工具——CRISPR—Cas系统。 后续的遗传学试验和生物化学试验也证实，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，很有可能是生物体抵御病毒等外来人侵者的一套特异性防御机制，就像是另外一套适应性免疫反应系统。 CRISPR系统基本结构 CRISPR系统由前导序列（leader sequence，LS）、 CRISPR基因座以及一系列Cas （CRISPR--associated）蛋白组成。 Leader序列： Leader序列前导序列由300～500bp碱基组成，位于CRISPR的5’端，与第一个重复序列直接相连，是一段在物种内相对保守的AT富集的区域。有研究表明前导序列是新插入序列的识别位点，也有研究指出，它能够作为启动子，启动CRISPR基因座的转录。 CRISPR基因座：CRISPR基因座由简短稳定的同向重复序列 direct repect，DR 和长度相近的非重复的间隔序列 spacer 间隔排列而成，称为R-S结构。其中重复序列的片段长度在21～48b，且含有5～7 bp的回文序列，通常能形成稳定的茎环结构，间隔序列的长度在26～72 bp，可能来源于噬菌体、质粒等外源DNA序列。 Cas基因：cas基因是存在于CRISPR位点附近的一系列基因，cas基因簇通常由4～10个保守基因组成，它表达出的cas蛋白对CRISPR防御机制的实现不可或缺。cas基因根据其保守程度可分为核心cas基因、亚型特异性cas基因和重复序列相关未知蛋白 repeat．associated mysterious proteins，RAMP 组件基因。 cas1～6基因广泛存在于各种CRISPR亚型中，故被称为核心cas基因，其编码蛋白的功能现已初步得到证实，例如，Casl和Cas2蛋白在所有CRISPR类型中均存在，主要在获取新的重复序列过程中发挥作用，Cas3则具有核酸酶和解旋酶的功能，主要作用是剪切目标基因。 CRISPR的工作原理 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下CRISPR 被转录为长的RNA前体 Pre RISPR RNA，pre-crRNA ，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。 CRISPR被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。 研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。 作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas有以下特点和优势： 1、操作简单，靶向精确性更高。 2、CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。 3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等 4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。 5、无物种限制。 6、实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。 三、局限性转导 specialized transduction 局限性转导：是指以噬菌体为媒介，只能将供体菌特定的一个或几个基因转移到受体菌中的转导现象。 导致局限性转导的一般都是温和噬菌体，它们在供体菌染色体上具有特定的整合位点。在某些条件下，当这种整合状的原噬菌体脱离寄主染色体时，偶尔会将整合位点两端相邻的基因错误地切离下来，并组装到噬菌体颗粒中。当这种噬菌体感染另一细菌时，就将原寄主的基因转移到另一细菌中。 1 高频转导的原理 不正常环出形成特殊性转导颗粒 这种缺陷噬菌体亦是转导噬菌体，它具有感染能力，能整合到寄主染色体相同的位点上形成稳定的转导子。 所得转导子的频率约为10-6，称为低频转导。 当携带有gal基因的λ缺陷噬菌体和正常的λ噬菌体在同一细胞时，正常λ噬菌体整合到寄主的染色体上后，产生两个杂合 细菌/噬菌体 att位点，λdgal缺陷噬菌体就可以整合到该位点上。 高频转导子的