第五节蛋白质的分离纯化和表征一.ppt

第五节蛋白质的分离、纯化和表征 一、蛋白质的理化性质 ? （一）蛋白质的两性解离与等电点： 由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上及末端存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的等电点。 （二）蛋白质的胶体性质： 蛋白质分子的颗粒直径已达1~100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 布郎运动、丁道尔现象、不能透过半透膜等。 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固： 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性。 引起蛋白质变性的因素有： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等； ② 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。 变性蛋白质的性质改变： ① 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ② 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。 蛋白质变性的可逆性： 蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下是不能复性的； 如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或者蛋白质具有特殊的分子结构，并经特殊处理则可以复性。 核糖核酸酶的变性与复性 蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。 变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。 加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。 二、蛋白质的分离与纯化 （一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。 分段盐析 2. 有机溶剂沉淀蛋白质： 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是： ① 脱水作用； ② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 （二）电泳： 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。 （三）层析： 层析是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。 凝胶过滤分离蛋白质 （四）超速离心： 利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。 * （二）蛋白质的呈色反应 　　(一)茚三酮反应 　　α－氨基酸与茚三酮作用时，产生蓝紫色反应，由于肽、蛋白质是由许多α－氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。 　　(二)双缩脲反应 　　蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上－CO－NH－键的化合物都呈此反应，肽和蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连，因此，所有蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应。 O O H O 2NH2-C-NH2 NH2-C-N-C-NH2 +NH3 　 反应名称 试 剂 颜色 反应有关基团 有此反应的蛋白质或氨基酸 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫色或粉红色 二个以上肽键 所有蛋白质 米伦反应 HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物 红色 ? Tyr 黄色反应 浓HNO3及NH3 黄色、橘色 ? Tyr、Phe 乙醛酸反应 (Hopking-Cole反应) 乙醛酸试剂及浓H2SO4 紫色 ? Trp 坂口反应 (Sakaguchi反应) α-萘酚、NaClO 红色 胍基 Arg 蓝色 ? —OH N 茚三酮反应 茚三酮 氨基及羧基 α-氨基酸 蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）； 2）带相同电荷。 + + + + + + 电泳 离子交换层析 吸附层析 凝胶层析 亲和层析 *