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研究背景 PyNPase是一种肿瘤细胞中的可逆性磷酸水解酶，也是嘧啶核苷补救代谢途径中的关键酶，广泛分布于微生物及动植物组织细胞中。 已发现三种类型的嘧啶核苷磷酸化酶，即尿嘧啶核苷磷酸化酶(Uridine phosphorylase，UrdPase)、胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase，dThdPase)，嘧啶核苷磷酸化酶(Pyrimidine nucleoside phosphorylase， PyNPase)， UrdPase存在于动物体内， dThdPase存在于人体内，而且在肿瘤组织高于正常组织，在办肠道肿瘤和乳腺肿瘤又高于其他肿瘤。 许多研究表明，PyNPase活性在肿瘤组织中明显高于周围正常组织，能使抗癌药物5′-脱氧-5-氟尿苷(氟铁龙，5′-dFUrd)转变成它的活性形式5-氟尿嘧啶(5-Fura)，从而抑制胸苷酸合成酶活性，最终抑制肿瘤的生长。 临床上主要用于治疗肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌膀胱癌等。 目的、意义 目的：构建PyNPase突变体基因表达载体，并通过点突变完成基因重组载体的构建，最终完成表达载体的构建，从而研究PyNPase的生理机制，进而为该酶的生理活性与生理结构的研究奠定坚实的基础。同时也为一些肿瘤疾病的控制甚至攻克奠定基础。 意义：PyNPase活性在肿瘤组织中明显高于周围正常组织，并且能改变抗癌药物5′-脱氧-5-氟尿苷(氟铁龙，5′-dFUrd)成为它的活性形式5-氟尿嘧啶(5-Fura)，抑制胸苷酸合成酶活性，从而抑制肿瘤的生长，PyNPase是能够抑制肿瘤生长的一种酶，在治疗肿瘤等癌症有很好的效果。因此，对嘧啶核苷磷酸化酶突变体基因及其表达的研究具有重要的意义。 研究方法 对PyNPase基因进行点突变，将Exiguobacterium sp. MY02菌株的PyNPase肽链中第82位Arg残基突变为His基因； 通过设计特异引物进行PCR扩增引入PyNPase基因序列中的突变位点，连接到pBAD/gⅢA表达载体中，构建PyNPase突变体基因表达载体； 用L-arabinose诱导表达，并对其表达条件(诱导时间、诱导剂浓度)进行优化，为进一步研究是否该位点对活性有显著影响以及为PyNPase基因的活性机制和结构机理研究奠定基础。 研究结果 重组T质粒DNA的提取 PCR扩增产物 重组子筛选 双酶切鉴定 诱导剂浓度条件优化 诱导时间条件优化 下一项目 重组T质粒DNA的提取 碱裂解法提取含有PyNPase突变体基因重组T载体质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，迁移快的为超螺旋结构，此质粒全长为4.1kb，呈现条带较均一、清晰，适合进行PCR扩增。 图1 重组T质粒的提取 1. DL15000bp; 2-5. 重组T质粒 6. 空载体. PCR扩增产物 以提取到的含有PyNPase突变体基因的重组T载体质粒DNA为模板进行PCR扩增，设置阴性对照，琼脂糖凝胶电泳图谱如图，扩增产物片段大小为约1300bp，与理论值基本相符合，可以进行筛选重组子双酶切，构建突变体基因表达载体的实验研究。 图2 PCR产物 1. DL15000bp; 2. PyNPase 基因 3. 阴性对照. 重组子筛选 将PCR扩增的目的基因与表达载体用相同限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切，再将突变体基因连接到pBAD/gⅢA表达载体中，转化宿主菌E coli TOP10F’ 中培养，碱裂解法提取含有PyNPase突变体基因的重组载体，为超螺旋结构，电泳检测如图，随机挑取6个单菌落提取质粒，有5个明显的对照有差异，为阳性重组子。 图3 重组子筛选 1. DL15000bp; 2,3,3,4,6,7. 阳性重组子; 5. 假阳性; 8. 空载体. 双酶切鉴定 将筛选到的阳性重组子用Nco I和Xba I双酶切和PCR鉴定，0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测如图，PCR扩增产物以及切出1.3 kp的目的基因片段和4.1 kp载体片段(图5)，与预期片段相符，说明目的基因已正确插入表达载体中。经核苷酸序列分析，阅读框架正确。 图4 双酶切鉴定 1. DL2000bp; 2. PCR产物; 3. pBAD/gIII A载体双酶切; 4. 重组表达载体双酶切; 5. DL15000bp. 诱导剂浓度条件优化 重组TOP10F’菌接种于含氨苄青霉素LB培养基中，37℃培养过夜，1%接种于该LB培养基中，分为6管，做好标记，培养3 h，加诱导剂L－阿拉伯糖至终浓度分别为2×10-1 %、2×10-2 %、2×10-3 %、2×10-4 %、2×10-5 %，32℃继续培养6 h，取1 ml菌液，离心收集细菌，加入1×SDS