眼针疗法干预MCAO模型大鼠抗氧化机制的研究.docVIP

眼针疗法干预MCAO模型大鼠抗氧化机制的研究 　　随着人口老龄化的加重，中风病发病率也随之提高，严重威胁着人类健康，探索中风病发病机制及有效防治方法成为医疗工作者的首要任务。眼针是以祖国医学脏腑经络理论为基础，根据眼球结膜上血管的形色变化，判断性质和部位，然后辨证针刺眼周特定穴位以治疗全身疾病。根据后天八卦将眼周分为八个区，再与五脏六腑联系起来，治疗急性缺血性中风时选取肝区、肾区、上焦区、下焦区以滋肾阴，清肝火，输通上下焦气机，活血通络，使病得愈。 　　眼针对于缺血性中风的疗效已为众人所承认，但其作用机制尚不清楚，本研究拟采用动物实验的方式，探索眼针对缺血性脑病的抗氧化作用机制。 　　1实验材料 　　1.1实验动物 SPF级SD大鼠60只，购自中国医科大学，许可证号：SCXK（辽）2008-0005。大鼠购入后适应性饲养1w，1w后用于正式试验。大鼠饲养于通风干燥的环境中，室温（18±2）℃，相对湿度45%。常规颗粒饲料喂养，自由饮水，12h昼夜节律，更换1次/d垫料，以保证大鼠生存环境洁净。 　　大鼠体重均匀，均在（300±30）g范围，毛色纯白，富有光泽，活动度适中，晚间活动度增加，步态正常，行为学观察未见异常大鼠。 　　1.2仪器设备 恒温水浴振荡器，SHA-B型，常州国华仪器设备厂生产。电子天平，JY5002型，0.01g～500g，上海精密科学仪器有限公司生产。电子天平，BS223S型，0.001g～220g，北京赛多利斯仪器系统有统公司生产。微量移液器，美国热电公司生产。紫外分光光度计，T6新世纪型，北京普析通用仪器设备有限公司生产。 　　1.3实验试剂及耗材 MDA、SOD和GSH-PX测试盒购自南京建成生物研究所。针灸针购自成大方圆连锁药店（陵东分店）。冻存管、吸头、PCR管等耗材均购自沈阳博尔美生物有限公司。 　　2实验方法 　　2.1实验动物模型的复制 　　2.1.1脑缺血再灌注大鼠模型的复制 参考马贤德[1]等人发表的线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究一文复制脑缺血再灌注大鼠模型。模型复制成功后，栓塞2h后，拔除栓塞线，进行再灌注，再灌注时间为72h。 　　2.1.2假手术组动物模型复制 假手术组手术方式同模型组，但不做栓塞，仅暴露出右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），然后逐层缝合即可。 　　2.2模型评价 神经功能缺损评分：参考Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉完全清醒后进行评分[2]。0分：没有神经损伤；1分：对侧前爪不能自由伸展；2分：向对侧旋转；3分：向对侧翻到；4分：行走不自由，意识模糊。分值越高，说明动物所表现出的问题就越多。选取评分在1～3分的动物模型进行试验。 　　2.3实验分组及干预因素施加 　　2.3.1实验分组 SPF级SD大白鼠60只，随机分为四组：空白对照组（10只），假手术组（10只），MCAO模型对照组（20只），眼针治疗组（20只）。 　　2.3.2各组干预因素施加 空白对照组，常规饲养，不施加任何干预。假手术组，采用2.1.2中所述方法，复制假手术模型，模型复制后正常饲养，不做任何处理，模型复制后72h进行相关指标检测。MCAO模型对照组，采用2.1.1中所述方法，复制脑缺血再灌注模型，模型复制后，正常饲养，不做任何处理，于再灌注72h进行相关指标检测。眼针治疗组，采用2.1.1中所述方法，进行MCAO模型复制，再灌注即刻开始进行针刺治疗，2次/d，连续3d。于再灌注72h进行相关指标检测。 　　2.3.3眼针取穴及刺法 取13mm毫针，眼针组选定大鼠眶周2mm处进行针刺，选择的位置比对人体取穴措施[3，4]，选取肝区、上焦区、下焦区、肾区，见图1。采用针刺的手段：从眼眶边缘2mm部位进行平刺，左眼从顺时针方向（右侧按逆时针方向），从该穴区起始定位线向终止定位线进针，进行平刺操作，刺入真皮，达到皮下组织，进针3mm，到终止定位线为止。留针20min，留针10min时用刮柄进行刮针1次，刮针5下。 　　图1 眼针定位示意图 　　2.4指标检测 　　2.4.1死亡率和神经功能缺损评分观测 各组大鼠模型复制成功后，进行再灌注前参考神经功能缺损评分标准进行行为学评分，以评价模型复制成功情况。末次针灸后，清点各组大鼠数量，计算总死亡率，并对各组大鼠再次进行神经功能缺损评分，统计分析组间差异。 　　2.4.2 各组大鼠血清中MDA、SOD和GSH-PX含量测定 各组大鼠末次针灸后，以10%水合氯醛（3.5ml/kg体重）腹腔麻醉，剖开腹部，经腹主动脉采血，静置1h后，2000转/min，离心10min，分离血清备用。 　　采用比色法对各组大鼠血清中MDA、SOD、GSH-PX的含量进行测定。