维脑康及银杏总内酯对局灶性脑缺血再灌注自噬和神经发生作用研究.docVIP

维脑康及银杏总内酯对局灶性脑缺血再灌注自噬和神经发生作用研究 　　[摘要] 目的：观察维脑康及其活性成分银杏总内酯对局灶性脑缺血再灌注的保护作用及其机制。方法：采用大鼠60 min中脑动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）/24 h～14 d再灌注模型。蛋白免疫印迹法检测自噬基因Beclin-1表达。透射电镜观察神经元超微结构变化。免疫荧光法检测缺血侧神经发生。结果：维脑康（20，10 mg·kg-1，ig）及其组分银杏总内酯（10，5 mg·kg-1，ig）可促进缺血侧新生成熟神经元 （BrdU+-MAP-2+） 产生，抑制自噬基因Beclin-1表达，最终减轻缺血再灌注带来的神经元损伤。结论：维脑康可抑制缺血周边区神经元自噬、促进神经发生，说明自噬可能是有效中药维脑康促进缺血脑区自修复功能的干预靶点。 　　[关键词] 维脑康；银杏总内酯；缺血/再灌注；自噬；神经发生 　　脑缺血后神经发生是脑损伤自我修复的重要机制[1]。脑缺血可以激活自体的神经干细胞增殖、迁移、分化，诱导损伤区域内神经发生向神经元方向分化并在神经组织内整合。因而，采用干预手段， 创造CNS中受损神经元生存的合适环境，激活自身的NSC 和内源性修复机制，增加自体的神经发生，在早期血管性痴呆防治中具有重要意义[2-3]。目前关于有效中药促进脑缺血损伤晚期神经发生的相关作用和机制研究报道较少。 　　维脑康（WNK）是提取自藏红花、人参和银杏的有效部位。据文献报道，维脑康主要有效成分人参总皂苷、银杏叶总酮酯、藏红花总苷均有增强记忆的功能[4-6]。其中银杏叶制剂在美国市场已有标准化商品，不仅作为滋补品和记忆增强剂销售，而且还逐渐用于与年龄相关的记忆损害、痴呆和外周动脉阻塞等疾病的治疗，并取得良好疗效。目前针对银杏提取物包括银杏内酯治疗血管性痴呆及减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究主要集中于改善微循环及代谢、抗血小板活化因子活性、清除自由基和抗氧化作用和抗感染作用[7-9]，未见关于WNK和银杏促进缺血后神经系统修复和再生的报道。因而在已有报道基础上，本研究从抑制自噬和恢复神经发生角度比较维脑康及其有效成分银杏总内酯治疗局灶性缺血再灌注损伤、改善记忆的可能机制，对相关中药治疗血管性痴呆预后及神经功能的恢复具有借鉴意义。 　　1 材料 　　1.1 动物 雄性SD大鼠，体重（250±20） g，购自中国医学科学院动物实验研究中心，许可证号SCXY（京）2004-0001。 　　1.2 药物 银杏总内酯（bilobalide）由上海傲拓信息科技有限公司提供，其中含银杏内酯B（GB）42.85%，银杏内酯A（GA）43.83%，银杏内酯C（GC）7.14%。维脑康（WKN），棕色粉末，由银杏、人参和西红花经乙醇回流提取、大孔树脂洗脱纯化后得到，其主要有效成分有银杏总酮酯、人参总皂苷、西红花总苷等，其中银杏总酮酯的含量占维脑康50%以上。银杏总内酯和维脑康临用以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成所需浓度供灌胃给药。 　　1.3 试剂 BrdU 和HRP标记的山羊抗兔IgG购自Sigma公司；小鼠抗BrdU 抗体购自Santa Cruz公司；兔抗微管相关蛋白2 （microtubule-associated protein-2，MAP-2） 多克隆抗体和兔抗Beclin-1多克隆抗体购自Cell Signaling公司。FITC和Cy3标记抗鼠和兔IgG为Beyotime公司产品。氟化聚偏乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）微孔转移膜购自Millipore公司。超敏感底物发光试剂盒（SuperSignal West Femto kit）购自Pierce公司。 　　1.4 仪器 转移电泳槽 （Mini Trans-Blot Transfer Cell， BIO-RAD公司）；垂直板电泳槽（Mini-PROTEAN 3 cell， BIO-RAD公司）；DYY-10型电泳仪（北京六一仪器厂）；TS-1型脱色摇床 （江苏海门市麒麟医用仪器厂）；AE240型电子分析天平（METTLER公司）； Bio-Rad Image LabTMXRS+凝胶图像分析管理系统（BIO-RAD公司）。 　　2 方法 　　2.1 分组及给药 雄性SD大鼠随机分为6组，每组12只（缺血后24 h及14 d处死各6只）：假手术对照组（sham），脑缺血再灌注（ischemia/ reperfusion，I/R）模型组，银杏总内酯高、低剂量组（10，5 mg·kg-1）， WNK高、低剂量组（20，10 mg·kg-1），给药体积5 mL·kg-1，于MCAO手术后3 h及12 h各灌胃给药1次，I/R组和sham组灌以等