HPLC—HRMS鉴定抗癌先导物T—OA在鼠尿中的代谢产物.docVIP

HPLC—HRMS鉴定抗癌先导物T—OA在鼠尿中的代谢产物 　　[摘要] 目的：研究抗癌先导化合物T-OA（齐墩果酰基-3， 5， 6-三甲基吡嗪-2-甲酯）在大鼠尿液中的代谢产物，初步推断其在大鼠体内的代谢方式。方法：收集空白组、原料组（川芎嗪TMP与齐墩果酸OA摩尔等量）及T-OA组大鼠尿液；尿液冷冻干燥，固体经乙酸乙酯超声提取后，提取物用色谱乙腈复溶；HPLC-HRMS联用技术在ESI+和ESI-模式下寻找可能的质谱峰，通过对比3组谱图的异同得出代谢产物的相关信息。结果：原料组鉴定出1个OA的代谢产物和2个TMP的代谢产物；T-OA组未检测到原料的代谢产物，而得到1个Ⅱ相代谢产物。结论：在大鼠尿液中首次鉴定出1个T-OA的Ⅱ相代谢产物，1个OA的Ⅱ相代谢产物，初步推断T-OA在体内不以原料的形式发挥药效；所建立的HPLC-HRMS方法可用于相关衍生结构的代谢产物鉴定；该文也可为以齐墩果酸为母体的前药设计提供一定的借鉴。 　　[关键词] 抗癌先导物T-OA；大鼠尿液；代谢产物；HPLC-HRMS 　　[收稿日期] 2013-11-25 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目；北京中医药大学创新团队项目（2011-CXTD-15） 　　[通信作者] *雷海民，博士，教授，研究方向为中药先导化合物的发现与开发，E-mail： hm_lei@126.com 　　[作者简介] 绪扩，硕士研究生，E-mail： xukuoworld@126.com 　　中医药理论指导下，以天然活性成分为母体的药物设计与结构修饰研究得到了较多的关注[1-3]。应用生物电子等排原理与拼合原理等现代药学理论及方法寻找选择性强、副作用小、生物利用度高的四甲基吡嗪系列衍生物的研究已有较长时间[4-5]。本课题组前期以经典组方“十全大补丸”中的活性成分为原料设计并合成一系列四甲基吡嗪衍生物[6]。通过体内外药效学评价，初步得到一个具有抗癌活性的先导化合物T-OA（齐墩果酰基-3，5，6-三甲基吡嗪-2-甲酯），见图1，已申报国家发明专利[7]。现有研究资料表明，T-OA具有抑瘤作用的高度选择性、低毒性以及多靶点的特性：对肝癌Bel 7402细胞（IC50= 7.611 mg·L-1）及结肠癌HCT-8细胞（IC50= 9.273 mg·L-1）表现出较强抑制作用；体内对S180肉瘤具有较显著的抑制效果，抑瘤率可达50%；而口服给药的半数致死量超过6.0 g·kg-1[8]。 　　图1 抗癌先导化合物T-OA的化学结构式 　　Fig.1 The structure of antitumor lead compound T-OA 　　本文旨在采用HPLC-HRMS联用技术对抗癌先导物T-OA在大鼠尿液中的代谢产物进行研究，建立相应的质谱检测方法，并通过对比T-OA组与空白组、原料组（TMP/OA摩尔等量）大鼠尿样中化学成分的异同，初步推断先导物在体内的代谢方式。以期进一步完善抗癌先导物T-OA的相关研究，也为今后以齐墩果酸为母体的前药设计提供一定的借鉴。 　　1 材料 　　1.1 仪器 　　HPLC-HRMS联用系统： Thermo Accela 超高效液相色谱仪（Accela 600泵，配备Accela Open自动进样器与四元溶剂控制器）；Thermo LQT Orbitrap XL质谱检测器；Xcalibur工作站；超纯氦气为碰撞气；高纯氮为雾化气。FD-1A-50冷冻干燥机（北京博医实验仪器有限公司）；飞鸽牌TDL-5-A低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；金龙鱼大豆油（天津嘉里粮油有限公司；批号2013/03/02）；T-OA对照品（实验室自制；批；川芎嗪与齐墩果酸（上海迈瑞尔化学技术有限公司）。 　　1.2 动物 　　健康SD大鼠15只（随机分为3组），雄性，体重（180±5） g，普通级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证SCXK（京）2012-0001。 　　2 方法 　　2.1 色谱-质谱条件 　　HPLC检测条件：Agilent ZORBAX？SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相由水（A）-乙腈（B）组成；采用线性梯度洗脱，0～60 min，5%～95% B；紫外波长208 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL；柱后按4∶1分流，进质谱检测器。 　　质谱检测条件：ESI离子源，扫描方式ESI+和ESI-模式，毛细管电压为+4 kV和-3 kV；锥孔电压±110 V；离子源温度300 ℃；毛细管温度350 ℃；碰撞气为氦气，碰撞能35 V；鞘气流量35 L·min