兔肌肌酸激酶大实验的分离纯化流程为将兔子颈动脉放血杀死后剥皮.docVIP

实验十二 兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定 一、实验原理 肌酸激酶 Creatine Kinase（CK）通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应： 肌酸激酶有四种同工酶形式：即肌肉型（ＭＭ）、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，上述3种肌酸激酶为胞浆肌酸激酶，而MiMi型存在于线粒体内膜上。 细胞在线粒体上发生氧化磷酸化，产生ATP。但动物体内贮存能量的高能物质不是ATP而是磷酸肌酸。能量贮存和运送是通过磷酸肌酸穿梭机制(Creatine Phosphaate Shuttle)来完成的，这个机制包含了肌酸激酶的线粒体型和肌肉型两种同工酶。氧化磷酸化产生的ATP在ATP-ADP转位酶(Translocase)的帮助下被直接送到位于线粒体内膜外侧的线粒体型肌酸激酶所在部位，线粒体型肌酸激酶将ATP内的高能磷酸键转移到肌酸上，变成ADP和高能物质磷酸肌酸。磷酸肌酸在胞内扩散到达肌原纤维(Myofibrils)，肌原纤维的M-区带上结合有肌肉型肌酸激酶，当肌肉收缩时，需要大量的ATP供给能量，肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸转化为ATP，而反应产生的肌酸再扩散回线粒体，重新磷酸化。 肌酸激酶同工酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前认为在心肌梗塞的诊断中，测定肌酸激酶的活性比作心电图更为可靠。鉴于这个酶具有重要的生理功能和临床应用价值，因而引起人们广泛的重视和深入的研究。 肌肉型肌酸激酶分子是有两个相同的亚基组成的二聚体。根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子量为43000左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。根据旋光色散研究的结果，这个酶的亚基大约有25-30％的α-螺旋，15 ％左右的β-折叠。 肌酸激酶是由两个亚基组成的寡聚酶，该酶在催化过程中，最小功能单位是亚基还是二聚体，一直是有很大争议的问题。我系生化与分子生物学教研室的王希成教授等用化学修饰和分子杂交的方法证明了肌酸激酶的两个亚基分别在二聚体中独立地起催化作用，即最小功能单位是亚基。 肌酸激酶的纯化方法有许多种，本实验采用的提纯方法为改进的Kuby 法。该酶的测活方法也有许多种，本实验采用的是pH-比色法。 肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）如下： 肌酸激酶在催化正向反应时，随着ATP向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的H+，其最适pH为7.5～9.0，是一个宽阔的平台状，在此范围内测定H+ 的生成速度，可以作为酶活力的指标。本实验采用百里酚蓝作为pH指示剂，在分光光度计上通过pH-比色法测定肌酸激酶的活性，在597nm波长下，监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化反应生成的H+使溶液的pH值降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光度值A597不断降低。肌酸激酶测活的底物溶液通常可配制20ml，当天使用。配制方法为：取10ml 48mmol/L的肌酸溶液，加入1.0ml 0.1mol/L的MgAC2，2.0ml 0.1％的百里酚蓝(称100mg百里酚蓝，加20ml乙醇溶解后再加水60ml)，1.0ml 0.1mol/L pH9.0的Gly-NaOH 缓冲液，称48mg ATP溶于此溶液，再补加水5.0ml，用0.1～0.2mol/L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为1.8～2.0）即可。 测活时，取1.0ml的底物溶液置于微量比色皿中，加入10(l 酶溶液，迅速盖盖，混匀后立即监测597nm 处光吸收的变化，每15 秒或30 秒(A597 )，共读取5～6个数据点，用A597 对时间作图，从图中求出每min吸光度值的变化，即 △A597，按下式计算酶的比活力（U）： [μmol／(min(g)] 其中：1.3 为吸光度的变化换算成H+的系数。VA =1.0ml (底物溶液)，VB =0.01ml (加入的酶溶液)。C为加入酶溶液的浓度。酶溶液浓度C的测定按其在280nm 处的吸光度值来确定，其百分吸光系数为 E1％1cm=8.8。 二、实验步骤