基于GSN稳转肝癌细胞的转录组新基因研究.docVIP

基于GSN稳转肝癌细胞的转录组新基因研究 　　摘要：目的 凝溶胶蛋白（Gelsolin， GSN）是凝溶胶蛋白超家族的成员之一，被发现对肿瘤转移具有促进作用。本研究旨在构建GSN双标签慢病毒载体，发现GSN过表达肝癌SMMC7721细胞转录组新基因。方法 PCR扩增GSN cds全长片段，接入带FLAG-HA双重标签的PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro慢病毒载体中，经测序鉴定的重组质粒，病毒包装后转染人肝癌细胞SMMC7721，嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系；In-Cell Western（ICW）检测GSN在SMMC7721肝癌细胞中的表达，Ion proton测序系统对转染及未转染的肝癌细胞进行mRNA测序。结果 测序表明重组质粒DNA序列与NCBI检索到的GSN编码序列一致；ICW检测到稳定转染细胞中GSN蛋白的表达为未处理细胞的2.02倍（P4。结论 基于GSN稳定表达的SMMC7721肝癌细胞株所发现的转录新基因，为研究GSN在肝癌中的作用机制开拓新方向。 关键词：GSN；SMMC7721；慢病毒载体；转录组；新基因 GSN是一个钙离子和二磷酸磷脂酰肌醇依赖性肌动调节蛋白，主要有细胞质型和分泌型两个亚型，在细胞骨架重塑、免疫反应及磷酸肌醇信号通路中发挥重要作用[1]。研究表明GSN与引发细胞凋亡蛋白酶级联反应蛋白酶之一半胱天冬酶-3（CPP-32）作用，参与细胞凋亡[2]，同时对细胞生长和肿瘤转移也具有促进作用。本研究通过改造PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro慢病毒载体，构建人GSN稳定表达的SMMC7721肝癌细胞株，利用转录组测序技术进一步研究GSN过表达后对肝癌差异表达新基因的影响，为探讨GSN在肝癌中的作用机制奠定基础。 1资料与方法 1.1一般材料 肝癌细胞SMMC7721及293T细胞购于中国科学院上海细胞库，澳洲胎牛血清购于Bioind公司，RPMI 1640培养基及DMEM 高糖培养基购于Hyclone公司，GSN表达载体由上海桑尼生物科技有限公司测序，X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent购于Roche，基因组DNA提取试剂盒、质粒大提试剂盒为天根生化科技有限公司；GSN鼠抗人一抗、GAPDH兔抗人一抗购自美国Epitomics公司，IRDye 680标记、IRDye 800标记的二抗购于美国LI-COR公司，RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司，RNA 纯化免疫磁珠试剂盒购于Life Technologies公司。转录组测序交Life Technologies公司完成。 1.2载体构建及细胞转染 1.2.1 PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体改装 用Xbal和BamH1酶切PCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体，纯化回收后接入FLAG-HA tag，转化大肠杆菌DH5α后涂板，挑选阳性克隆，37℃过夜扩增后提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测结果。 1.2.2引物合成及GSN全长FLAG-HA双标签重组质粒构建 以人肝组织cDNA为模板，PCR扩增GSN cds全长片段，上游引物5′-gctccgcaccgccccgcgc-3′，下游引物5′-tggctgagctggctgcctga-3′，PCR 条件：94℃预变性3 min，94℃×20 S，54℃×20 S，72℃×40 S，共28个循环，72℃延伸10 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。用BamH1酶切改装的载体pCDH-CMV-FLAG-HA- EF1-Puro后接入GSN，构建出GSN全长的重组质粒，交上海桑尼生物科技有限公司测序。 1.2.3病毒包装及肝癌细胞转染 前1 d 293 T 铺板，细胞60%～80% 汇合度，转染。将病毒质粒和包装质粒按照比例混合，然后依照转染试剂说明书操作。转染后继续培养，3 d后搜集细胞上清，2000 rpm，5 min离心，去掉残留在上清中的293 T 细胞，经0.45 um 滤头过滤，备用。如长期保存置于-80℃冰箱冻存。对数期生长的肝癌细胞SMMC7721前1 d铺板 ，长至60%～80% 汇合度，25 cm2培养瓶加入1 mL病毒上清、5 mL培养基，同时加入polybrene，至终浓度 8 μg/mL，感染后48 h，细胞1∶5 传代后，加入嘌呤霉素筛选稳转细胞株，鉴定表型。 1.3 ICW鉴定GSN表达 将培养瓶内转染及未转染的SMMC7721肝癌细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用全培养基稀释成1×105/mL细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μL，各做5个复孔，培养至细胞处于生长增殖期，状态佳。ICW实验过程参照Yuli Wan[3]等的研究。GSN一抗及GAPDH内参浓度分别为1∶100和1∶4