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基因工程中的RNAi技术 学生：王勇 学号：2014107046 摘要：基因沉默技术已经被用来作为一种研究工具来研究某些细胞基因的功能。RNA干扰技术可引起细胞基因沉默。首先介绍RNAi的概念与起源和RNAi的作用机制与原理，随后介绍几种siRNA的获得方法及dsRNA的载体，最后对RNAi技术在研究功能基因应用方面进行展望。 关键词：RNAi技术 基因沉默 前言：随着人类基因组计划的完成，越来越多生物的全基因组被测序，人们对功能基因组学的研究越来越深入。研究思路通常从两个方面展开，一是增强某种基因表达，研究过表达后引起的一系列机理；二是减弱或者终止其表达，进而推测该基因相应的生理功能。干扰基于后者针对性很强的特点，逐渐发展成一种新技术— 基因沉默（Gene silencing）。从低等原核生物到高等真核生物，基因沉默技术的广泛应用推动了基因组学研究的革命化进程。文章对RNA干扰细胞引起基因沉默展开综述。 RNAi的概念与起源 1995年，康奈尔大学的Guo和Kemphues在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中发现了RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象。直到1998年，Fire和Mello等通过注射与秀丽隐杆线虫机体同源基因（靶基因）的双链RNA，阻断了靶基因的表达，并将其命名为RNAi，又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。RNAi潜在的作用促使Fire和TIllnnons继续实验，将能够表达出与C.elegsnns unc-22基因同源的双链RNA的细菌喂食线虫，结果线虫表现出类似unc-22缺失的表型。 随后人们又陆续在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planarian)、斑马鱼(Zebra fish)、拟南芥(Arabidopsis)、大小鼠和人体内发现了RNAi现象，遗传学研究表明RNAi是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制,与真核细胞中许多重要生物学过程密切相关。 斯坦福大学的Andrew Z. Fire教授和马萨诸塞州医学院的Craig C.Mello教授获得2006年诺贝尔生理学或医学奖,以表彰他们发现了RNAi现象。 RNA干扰的作用机制与原理 通过对RNAi现象的遗传学与生物化学研究,其作用机制已日渐清晰（图1）(Sharp,2001;Hnnano,2002;McManus&sharp,2002;Zamore,2002)，初步认为RNAi主要分为三个阶段。 图1 A Model for RNAi (science,vol296,page1264,2002) 起始阶段 dsRNA(double-strand-RNA，双链RNA)进入细胞，RNAi核酸酶与dsRNA结合，并将之降解成21~23bp的小片段dsRNA，这些小片段dsRNA被称为siRNA(small interference RNA)。siRNA与RNAi核酸酶结合成复合物。由于siRNA和RNaseⅢ切割产物的相似性，Benda Boss等认为在形成siRNA的过程中有RNaseⅢ的参与，Bernstein和他的同事发现果蝇中RNAi的发生与这种酶有关,他们把这种蛋白酶称为Dicer。除了含有两个RNaseⅢ共有区域外，Dicer还含有一个解旋酶区域、一个dsRNA结合区域和一个PAZ区域。Dicer酶具有高度保守性，在果蝇、烟草、线虫、哺乳动物和神经细胞中发现能够将相应种属的dsRNA加工成特定长度的siRNA。RNaseⅢ接触反应区域结构的阐明导致了Dicer切割产生22bp片段模型的建立。在该模型中，认为RNaseⅢ以二聚体酶形式起作用，反向平行的RNaseⅢ区域产生两个复杂的接触反应中心。 效应阶段 复合物中siRNA作为模板，其反义链与对应的同源mRNA结合，正义链解离出来，同时mRNA被降解并释放出RNAi核酸酶，然后重复这一过程，特异性降解下一个对应的mRNA。在果蝇中，RNAi通过一种称为RNA诱导沉默复合物(RNA一induced silencing complex，RISC)识别和降解目的mRNA。Zamore和他的同事们发现RISC在胚胎提取物中以大约250kDa大小的前体复合物的形式存在，在加入ATP(三磷酸腺苷)之后被激活形成约100KDa大小的能切割mRNA的复合物siRNA是双链结构，含有2个3，端突出碱基和一个5，端磷酸基团，该结构有利于siRNA与RISC复合物的结合。 扩增和扩散阶段 siRNA的反义链与目的mRNA结合后不仅诱导RISC对该基因进行降解，而且还激活RdRp(RNA dependent RNA polymerase，RNA依赖RNA聚合酶