一代测序规范流程.docVIP

PCR产物测序实验操作流程 实验试剂和耗材准备 （一）实验试剂 实验试剂 主要用途 核酸提取试剂盒 主要用于DNA或RNA的提取（详细步骤参考相应说明书） 上、下游引物 PCRExtender PCR-to-Gel Master Mix，2× PCR ddH2O PCR、测序反应及其它核酸荧光染料琼脂糖凝胶电泳 DNA Marker 琼脂糖凝胶电泳 TBE电泳缓冲液 琼脂糖凝胶电泳 琼脂琼脂糖凝胶电泳 I (Exo I) PCR产物的纯化 碱性磷酸酶(ALP) PCR产物的纯化 经纯化后的PCR产物 测序反应 BigDye v3.1 测序反应 100%酒精 测序产物纯化 125mM EDTA（PH=8） 测序产物纯化 70%酒精 测序产物纯化 POP7胶 上机测序过程（毛细管电泳） Hi-Di甲酰胺 上机测序过程（毛细管电泳） 毛细管电泳Buffer 上机测序过程（毛细管电泳） Sequence Standard（3500） 测序标准品（阳性对照） （二）、实验耗材 实验耗材 主要用途 1.5ml EP管 各种试剂的分装、盛放、储存等 1.5mlEP管支架 1.5ml或2mlEP管的支撑或存放 0.2mlPCR管 PCR 八连管及八连管盖 PCR 96孔板 PCR、测序反应及上机测序 各种规格微量移液器 微量试剂的定量和移取 各种规格移液器吸头 配合移液器的使用（吸附试剂） 96孔板支架 固定和支撑96孔板、八连管以及PCR单管 96孔板封垫 封板用 封板滚轮 封板用 冰 维持待反应试剂低温环境 各种规格量筒 溶液的稀释或试剂的配置 锥形瓶 琼脂糖凝胶的熔化 容量瓶 溶液的稀释与试剂的配置 药匙和称量纸 试剂的称量 凝胶槽和凝胶梳 琼脂糖凝胶的凝固和加样孔的形成 计时器 计时 记号笔 做各种记号或标记 一次性手套 防污染和保护作用 铝箔 封96孔板 二、实验仪器 实验仪器 主要用途 制冰机 制冰 电冰箱 试剂的储存 高速台式离心机 试剂的离心 Mini式离心机 瞬离试剂 旋涡式混合振荡器 混匀试剂 电子分析天平 试剂的称量 核酸检测仪 核酸纯度和浓度的检测 PCR仪 PCR 电泳仪和水平电泳槽 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像仪 核酸琼脂糖凝胶电泳的检测和分析 基因分析仪 DNA的测序或片段分析 蒸汽式高压湿热消毒器 试剂、实验耗材及用具的消毒 电热鼓风干燥箱 实验用品的干燥 恒温水浴锅 提供恒温环境 三、实验操作具体步骤 （一）核酸的提取 按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。 （二）测序PCR模板的制备 （1）、预先制备适量冰 （2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix （3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上 成分 体积（20μl体系） 终浓度 Extender PCR-to-Gel Master Mix，2× 10μl 1× 10μM上游引物 0.5-2μl 0.25-1μM 10μM下游引物 0.5-2μl 0.25-1μM 50ng/μl的模板 0.1-1μl 5-50ng ddH2O 根据需要 — （4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序 95℃ 5min→ （95℃ 30sec，67℃ 30sec -0.5 ℃/循环，72℃ 1min）x14循环→ （95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min）x 30循环→ 72℃ 7min→4℃ Forever （5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。 （6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I (Exo I)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃ 消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下： PCR产物 5μl Exo I 0.5μl 碱性磷酸酶 1μl （三）、纯化后的PCR产物的测序反应 1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释（若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮，可以适当稀释倍数）μM （1）PCR产物测序反应体系（10μl）： 成分 加入量 纯化并稀释好的PCR产物 1μl（也可参考下表） 引