培训课件-现代分子诊断技术.ppt

竞争法 测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体 双夹心法 测定大分子抗原 特异性相同，来源不同 3、使用多克隆抗体的缺点 ①同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异 ②无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化 单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置 4、酶联免疫吸附测定的局限性 仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行western检测 要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特异性 在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结合 第二节 DNA诊断系统 DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作为专一性的诊断标记 一、核酸杂交 1、工作原理： ◆ 两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成氢键 2、3个关键要素： ★ 探针DNA ★目的DNA ★ 信号检测 主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A U、 G≡C ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链 碱基互补 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 杂交 加入标记核酸探针 检测杂交信号 标记核酸探针 预杂交 制备核酸探针 漂洗去除未参与杂交的标记探针 3、杂交探针 必须是高度特异性的DNA片段 种级探针：区分两个或多个物种 亚种级探针：区分物种内特定的株系 DNA RNA 化学合成或克隆的完整基因 基因的一个片段 * Southern印迹杂交是经典的DNA分析方法。将DNA经限制性酶切及变性后，转移至膜上与标记探针进行杂交。主要用于基因组DNA的分析--检测特异的DNA片段并进行定位和测定相对分子质量；也可有用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等； 第七章 现代分子诊断技术 酶联免疫吸附测定 DNA诊断系统 DNA指纹 遗传性疾病的分子诊断技术 基因诊断 基因 蛋白质 性状 生化诊断 基因诊断 临床诊断 传统的诊断程序 先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质 实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异 诊断成本高、速度慢、效率低 如砂眼衣原体、朊病毒 方法 优点 缺点 显微镜镜检 简单易行，可直接观察到寄生虫的形态 速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生虫 体外培养、接种 能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度 速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料 抗体检测 简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的样品 无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生 DNA杂交及PCR 快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史 花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性 检测寄生虫感染的诊断方法的比较 现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测 一种有效的诊断方法应具备： 1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应 2、灵敏度 sensitivity 高 3、操作简单 simplicity 基因诊断的特点 特异性高 检测目标是基因，为原始的致病因素 灵敏度高 待测标本往往微量，目的基因只需pg水平 稳定性高 基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态 诊断范围广，适应性强 确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态 临床应用前景好 基因诊断优点 从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制 显著提早产前诊断的时间 无需对组织、器官或细胞进行选择 快捷准确、安全 基因诊断常用的技术 核酸分子杂交 PCR（聚合酶链式反应） 限制性酶切分析 SSCP（单链构象多态性分析） DNA 测序 DNA 芯片技术 DNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCP RNA Northern blot, RT-PCR, micoarrays Protein Western blot, Immuno-histochemistry, microarray Southern blot N N