分子生物学3.7解决方案.ppt

本节主要内容 3.7.1 真核生物RNA中的内含子 3.7.2 真核生物tRNA前体的转录后加工 3.7.3 真核生物rRNA前体的转录后加工 3.7.4 真核生物mRNA的剪接 3.7.2 真核生物tRNA前体的转录后加工 真核生物tRNA基因有内含子，其前体必须以过剪接。 3.7.2 真核生物tRNA前体的转录后加工 真核生物tRNA基因有内含子，其前体必须以过剪接。 tRNA内含子的特点 （1）长度和序列没有共同性，一般有16~46个核苷酸； （2）位于反密码子的下游。 （3）内含子和外显子的边界没有保守序列，所以其前体的剪接不符合一般规律。 真核生物tRNA转录后加工 真核生物tRNA前体内含子的精确切除信号是tRNA分子共同的二级结构。 真核生物tRNA转录后加工 (1)内含子的剪接 tRNA核酸内切酶切割前体分子中的内含子，RNA连接酶将外显子部分连接在一起 真核生物tRNA转录后加工 (1)内含子的剪接 （2）3`端添加CCA 在tRNA核苷酸转移酶的催化下在其3`端添加CCA。 真核生物tRNA转录后加工 (1)内含子的剪接 （2）3`端添加CCA （3）核苷酸修饰 例如： 地中海贫血病人的珠蛋白基因中，大约有1/4的核苷酸突变发生在内含子的5’或3’边界保守序列上，或者直接干扰了前体mRNA的正常剪接。 断裂基因发现不久，Crick（1978年）就提出了一系列发人深思的问题： Chambon等分析比较了大量结构基因的内含子切割位点，发现有2个特点： GU-AG法则（GU-AG rule）不适用于线粒体、叶绿体的内含子，也不适用于酵母的tRNA基因 。 核mRNA结构特点 1. 边界序列:其边界序列是完全符合GU-AG法则 2. 分枝点序列：具有分枝点序列，位于内含子3’端上游18-50nt处，序列为Py80NPy87Pu75APy95，其中A为百分之百的保守，且具有2’-OH。 3. 内含子5′端有一保守序列(5′GUAAGUA3’)可以和U1 snRNA的5’端的保守序列3’CAUUUCAU5’互补。 核mRNA的剪接 转录产生的核内mRNA前体分子与蛋白质结合，形成RNA和蛋白质组成的snRNP复合物（ribonucleo-protein protein）。 随着RNA链的延伸，每个内含子5’和3’两端的复合物成对联结，产生60S的颗粒—剪接体（spliceosome），进行RNA前体分子的剪接。 Autosplicing (Self-splicing,自我剪接) describes the ability of an intron to excise itself from an RNA by a catalytic action that depends only on the sequence of RNA in the intron. 和I类内含子剪接不同；和核mRNA 内含子的剪切有些相似，但也有不同之处。? Ⅱ类内含子分布在： 酵母mtRNA， 细胞色素氧化酶的α亚基，β亚基， 玉米mitochondrial RNA (mtRNA)，tRNA 真核mRNA前体中 Ⅱ类内含子的剪接无需鸟苷酸或鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。 The chemistry of group II intron splicing and RNA intermediates produced are the same as that of the nuclear pre-mRNA. 三类剪接反应都是通过两次连续的转酯反应进行的 由U1 snRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5’剪接点，由结合在3’剪接点上 游富嘧啶区的U2AF（U2 auxiliary factor）识别3’剪接点并引导U2 snRNP与分支 点相结合，形成剪接前体（pre-spliceosome）。 剪接前体进一步与U4、U5、U6 snRNP三聚体相结合，形成剪接体。 真核生物mRNA前体中内含子剪接过程示意图 RNA剪接中的两步转酯反应 第一步转酯反应是由位于分支位点的保守腺苷酸的2`-OH引发的。它作为亲核基团攻击5`剪接位点保守鸟苷酸的磷酰基团。结果，外显子3`端的核糖与内含子5`端磷酸之间的磷酸二酯键被断开，游离出来的5`磷酸则与分支点保守腺苷酸的2`-OH连接。因此，除了5`——3`骨架磷酸二酯键，新的磷酸二酯键从保守腺苷酸的2`-OH伸出来，产生一个三叉交汇点。 RNA剪接中的两步转酯反应 第二步转酯反应中，5`外显子作为亲核基团，攻击3`剪接位点的磷酰基团，导致两个结果：一是把5`和3`外显子连接起来了，二是把内含子作为离去基团