免疫组化和荧光解析.ppt

2014-3-21 免疫组化图片 免疫荧光图片 免疫组化与免疫荧光 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素等) 显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法；这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。 实验原理 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 显色来确定组织细胞内抗原；免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。 实验步骤 脱蜡水化： 二甲苯Ⅰ 20min 二甲苯Ⅱ 20min 无水乙醇Ⅰ 10min 无水乙醇Ⅱ 10min 95%乙醇 5min 80%乙醇 5min 75%乙醇 5min 50%乙醇 过一遍 蒸馏水 过三遍 高压修复 4min 流水冷却 PBS冲洗 5min×3次 抗原修复——原因 *常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得： -抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇； -蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 *要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 注意事项 标本固定 脱水、石蜡包埋和制片 脱蜡和水化 抗原修复 细胞通透 灭活内源性过氧化物酶和生物素 血清封闭 一抗和二抗浓度和孵育时间 抗体稀释液 切片清洗 DAB显色 避光 复染 封片 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象 1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用含有多聚赖氨酸的玻片；3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。 免疫组化常见问题的处理 标本无染色 ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂(一抗、二抗、三抗及底物等)。 ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。 ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配。 ④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。 ⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。 ⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。 ⑦ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 ⑧检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。 弱阳性 ① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。 ② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。 ③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。 ④ 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。 ⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。 产生组织切片非特异性染色 1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。 2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，可试用单克隆抗体