血红蛋白的提取和分离(完美修改).docVIP

专题五 课题3 血红蛋白的提取和分离 学习目标 1、理解凝胶色谱法、电泳法的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用； 2、掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。 一．基础知识 蛋白质的物化理性质： ，由此提取和分离各种蛋白质。 1．凝胶色谱法（分配色谱法）： （）概念：根据被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。 （2）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （3）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （4）分离过程：（图5－13b） 混合物上柱→ → 分子流动快、 分子流动慢→收集 分子→收集 分子 （洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。） 2.缓冲溶液 （1）作用：能够抵制 的对溶液的 的影响，维持PH基本不变。 （2）缓冲溶液的配制：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3NaH2PO4/Na2HPO4等）。通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成。 3.凝胶电泳法： （1）原理：不同蛋白质的 不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 （2）分离方法： 、 。 （3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的_______，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅___________________。 二．实验设计 1.蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？ 、 、 、 。 2.选择实验材料 （1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ _____________。___________________________________________________。 （2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题： 血液由 和 两部分组成。血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。 3.样品处理从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。 (1)红细胞的洗涤 ①目的：去除 ②方法： 离心 思考：加入柠檬酸钠有何目的？ (2)血红蛋白的释放 加入_________________，红细胞破裂，释放血红蛋白。其中加入甲苯的目的是溶解细胞膜。 (3)分离血红蛋白溶液 第1层（最上层）： 层（无色透明） 第2层（中上层）： 的沉淀层（ 色薄层固体） 第3层（中下层）： 的水溶液层（ 的液体） 第4层（最下层）：其它杂质的沉淀层（ 色） (4)透析： .凝胶色谱制作 .血红蛋白分离的完整过程：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 三、巩固练习 1. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（ ） A. 对其他分子的亲和力 B. 溶解度 C. 所带电荷多少 D. 相对分子质量的大小 2.用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ） A．路程较长，移动速度较慢 B.路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢 D.路程