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表达蛋白提取、纯化 免疫动物，验证其防治作用 乙肝疫苗 发展史 1964年发现澳大利亚抗原，1971年将含有高滴度的HBsAg血浆稀释后加热，接种志原者，证明能产生抗体，有保护力。在此基础上美国NIH作出了纯化血源苗。 我国1989年生产血源苗，效果是理想的，抗体阳转率在90%左右。但长期使用有安全性问题，而乙肝病毒无法在体外培养，因此发展基因工程疫苗成为乙肝疫苗换代产品的必然趋势，国内外相继研制出了真核表达的乙肝疫苗。 乙肝基因工程疫苗：将乙型肝炎表面抗原基因片段重组到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)内，通过对细胞培养增殖，增殖分泌乙肝HBsAg于培养液中，经纯化加佐剂氢氧化铝后制成。国产的是中国预防医学科学院阮力研制，从国外引进的是酵母细胞表达的乙肝基因工程疫苗。我国目前这两种疫苗用于预防乙肝，血源疫苗已经停止生产。 发展趋势 怎么解决5-15%无反应性 核酸疫苗 1990年，Wolff等首次发现，给小鼠肌肉注射裸露质粒DNA后，质粒携带的基因可被肌细胞摄取并在其中表达，还可诱生特异性免疫应答。 核酸疫苗（nucleotide vaccine）：又称DNA疫苗（DNA vaccine），是将一种或多种目的抗原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上；再将重组质粒直接注入到体内，在宿主细胞内表达目的蛋白，诱发特异性免疫应答。 目前进入临床试验的核酸疫苗有HIV DNA疫苗和疟疾 DNA疫苗。 核酸疫苗具有构建容易、生产方便、表达稳定、可诱发全面的免疫应答。 在抗感染、抗肿瘤免疫及疾病的预防等具有广阔的前景，被誉为疫苗的“第三次革命”。 核酸疫苗免疫机制 局部注射的核酸（重组质粒DNA）被周围的细胞（如黏膜上皮细胞、抗原提呈细胞）摄取后，进入核内进行转录，并在胞质中翻译成目的蛋白。 目的蛋白被蛋白酶复合体降解成含有表位的抗原肽，可作为： “内源性抗原”：与MHCⅠ类分子结合，诱发CTL介导的细胞免 疫应答。 “外源性抗原”：与MHCⅡ类分子结合，诱发Th1型免疫应答。 目的蛋白亦可通过细胞分泌或细胞破裂的方式进入组织间，以天然折叠形式激活B淋巴细胞而产生抗体。 DNA疫苗接种后，体内仅表达pg～ng水平的外源蛋白，但能诱发强而持久的细胞免疫和体液免疫应答。 如何解释这一现象？呢？ 目的基因（含载体质粒）含有CpG基序，能激活较强的CTL效应，并能激活巨噬细胞与NK细胞，因此，CpG回文序列被称为免疫刺激DNA序列。 CpG基序与IL-2、TNF-β、IFN-γ的基因结构相似而产生协同作用。 DNA疫苗的设计优化 联合构建：在载体质粒中插入2个或2个以上目的抗原基因，既能激活CD8＋T细胞，又能激活CD4＋Th2细胞。 协同构建：将目的基因与细胞因子的基因构建成嵌合基因，以促进目的基因的免疫效果。 免疫途径：常见免疫途径有肌肉注射、皮内或皮下免疫、粘膜免疫等。 基因枪（gene gun):用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的植物组织或者动物细胞中，这一加速设备称为基因枪。 已完成炭疽基因疫苗对兔子的活体实验：10只兔子麻醉，向它们的腹部发射炭疽菌DNA的疫苗“子弹” 。半年后，再对兔子注射炭疽菌剂量，其中9只兔子安然无恙，显示炭疽疫苗已成功生效。 核酸疫苗与传统疫苗的比较 传统免疫使用抗原是灭活病原体、减毒的活病原体或病原体的亚单位蛋白。核酸疫苗是病原体某种抗原的基因片段，与自然感染过程相似。 核酸疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效力。 核酸疫苗可在体内不断翻译表达，较长时间维持较高的蛋白水平，免疫具有连续性，一次接种可获得长期或终身免疫力。 灭活疫苗和亚单位疫苗在体内代谢较快，难以长时间维持较稳定的含量，需多次接种免疫原，加强免疫。 植物疫苗（plant-based vaccine）： 亦称转基因植物疫苗（transgenic plant vaccine），是指将抗原基因导入植物细胞并在其中表达，人食用已表达目的抗原的转基因植物后，可诱发特异性免疫应答的新型疫苗。 肿瘤疫苗： 是通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。 肿瘤细胞疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、树突状细胞疫苗、CTL表位肽疫苗等。 治疗性疫苗 目前出现了针对自身免疫性疾病（MS、SLE等）、Alzheimer氏病（AD）、I型糖尿病的治疗性疫苗。 基因工程疫苗的发展重点： 采用不同毒株之间的保守DNA序列作核酸疫苗，可使免疫作用突破地理株的限制，有效预防病原体发生变异，如丙型肝炎、甲型流感、艾滋病等。 核酸