第三章4 PCR引物设计课件.pptVIP

一、PCR引物设计原则 ＰＣＲ原理 1、引物是否必须是从基因片段起始端开始？ PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核酸片段，使其能有效地扩增目的DNA序列 十条PCR引物的设计原则总述 ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。（如何避免） ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？） ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体） ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5’端可以修饰。 ⑨ 引物3’端不可修饰。 ⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 有时由于模板的复杂性而无法判断，但尽量避免和基因内部有过高的同源性 哪些DNA片段可作为模板？GFP在质粒上，和GFP在基因组上？哪个作为模板，更容易得到专一的GFP片段？ 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20