欧李SRAP反应体系的建立与优化.docVIP

欧李SRAP反应体系的建立与优化 　　摘 要：采用正交试验设计，对影响欧李SRAP反应体系的5个因素（模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶）、4个水平进行优化。结果表明，适合欧李的SRAP反应体系为：2.50 mmol/L Mg2+ ，0.25 mmol/L dNTPs，0.60 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶0.50 U，1.00 ng/μl模板DNA，总体积为20 μl。优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对欧李进行种质遗传多样性评价、指纹图谱构建、基因组分析、分子标记辅助育种和遗传改良等研究奠定了基础。 　　关键词：欧李；SRAP；正交设计；优化 　　中图分类号：S662.502.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）09-0009-03 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　供试材料为怀柔汤河口采摘的野生欧李幼嫩叶片，液氮处理后，保存于-20℃冰箱备用。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 基因组DNA提取 采用改良的CTAB方法提取DNA[7]，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。-20℃保存备用。 　　1.2.2 正交设计 采用L16（45）正交试验设计，对SRAP反应体系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶浓度进行正交组合方案筛选（表1、表2）。SRAP引物由英骏生物技术有限公司合成，所用引物为：正向引物me2： 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′， 反向引物em1：5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′[8]。 　　1.2.3 PCR扩增 反应体系为20 μl，扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭（EB）染色后于凝胶成像系统采集图像。 　　1.2.4 反应体系稳定性检测 选用筛选出的引物对不同的野生欧李材料进行SRAP扩增，检测优化体系的稳定性。 　　2 结果与分析 　　2.1 欧李SRAP正交反应体系优化 　　正交试验设计SRAP-PCR反应体系选取me2/em1为引物，以野生欧李基因组DNA为模板进行扩增，结果见图1。 　　2.2 优化体系验证 　　选用筛选出的引物组合me2/em1和优化的反应体系对不同欧李野生植物材料进行扩增。由图2可知，扩增出的条带清晰、多态性强、稳定性好，说明该正交体系适宜欧李SRAP-PCR扩增。 　　1～11：不同野生欧李样品 　　图2 11种野生欧李SRAP优化体系扩增结果 　　3 讨论 　　SRAP作为一种新型的分子标记，具有操作简单、稳定、高效等特点，适用于遗传图谱构建、基因定位、基因克隆等遗传操作，目前，已在小麦、水稻、牡丹、西瓜、苹果、棉花、柑橘、樱桃、葡萄、柿等植物中应用[13～15]。SRAP-PCR扩增一般需要参考Li和Quiros的固定程序[16]，但其扩增结果受到反应条件、扩增程序及不同物种的影响[17]，所以，SRAP在不同的物种上应用需要进行反应体系的优化。目前，在欧李分子标记的研究中尚未见SRAP应用的报道，因此，探索适合该物种的最佳SRAP-PCR反应体系至关重要。 　　试验结果表明，欧李SRAP-PCR扩增的最佳反应体系为2.50 mmol/L Mg2+ ，0.25 mmol/L dNTPs，0.60 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶0.50 U， 1.00 ng/μl模板DNA，总体积为20 μl。本试验优化的SRAP-PCR反应体系稳定可靠、扩增结果多态性好，不仅适用于欧李基因组DNA的SRAP-PCR扩增，也为SRAP技术在欧李种质资源鉴定和遗传多样性分析等方面的研究奠定了基础。 　　参 考 文 献： 　　[1] 张 红. 中国矮生樱组遗传多样性研究及欧李优系S基因型鉴定[D].泰安： 山东农业大学， 2008. 　　[2] 关录凡， 王 鑫， 王秋玉. 利用ISSR分子标记检测欧李不同品种间的差异[J]. 森林工程， 2009， 25（3）： 17-22. 　　[3] 刘 明， 杜俊杰. 欧李种质资源的分布与品种性状表现[J]. 落叶果树， 2010， 3：18-20. 　　[4] 王有信， 何卫军， 李向东， 等. 欧李种质资源分布及种群分类特性研究[J]. 山西果树， 2005， 6：35-38. 　　[5] 张 飞， 王炜勇， 张 智， 等. 光萼荷属植物SRAP-PCR反应体系建立与引物筛选[J]. 中国农学通报， 2012， 28（