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实验五 定性酶联吸附试验1.ppt
检测中：1、加样要准确，每次应更换枪头 2、试剂使用前应摇匀，弃去1一2滴后垂直滴加 3、洗涤时，将洗涤液注满每孔，静置10秒钟，弃去孔内液体拍干，重复5次 4、本试剂盒及临床样本均应视为有潜在传染性，有任何试剂接触皮肤和眼睛，用大量清水清洗 5、终止液为硫酸，具有腐蚀性 检测后：1、用过的样品及试剂当具有传染性，适当处理 2、审核结果有效时再出报告单 本实验在什么情况下会出现假阴性及假阳性结果，如何避免？ * * 实验五 定性酶联免疫吸附实验（ELISA) ---双抗体夹心法测HBsAg 临床免疫学教研室 1.掌握双抗体夹心法基本原理、操作过程及结果判定。 2.了解ELISA方法在临床免疫学检验方面的应用。 一、实验目的 固相载体 单抗 抗原 酶 抗体 酶标记多 克隆抗体 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。 + 4.酶催化底物并显色。 双抗体夹心法 - 二、实验原理 待检血清 市售HbsAg诊断试剂盒 微量移液器、枪头、酶联免疫检测仪、吸水纸、试管架等 三、实验器材 1、实验前准备： （1）试剂：从冷藏环境中取出试剂盒，在室 温下平衡30min; 洗涤液用蒸馏水作20倍稀释； （2）标本：3000rpm离心10min，分离血清/血浆。 四、实验步骤 第1孔： 空白对照 不加样品 第2-3孔：阴性对照 100μl/孔 第4-5孔：阳性对照 100μl/孔 第6孔-N孔： 待测血清 100μl/孔 2.具体步骤 加样 加酶结合物（空白孔 除外）100μl/well 震荡混匀 37℃温育60min； 加终止液 50μl/well 加底物液、显色液各 50μl/well 在λ＝450nm处 读取吸光值 37℃，避光，30min 震荡混匀，贴上封板膜， 37℃温育30min； 甩去孔内液体，拍干；洗涤液注满每孔，静置5-10s，弃去洗涤液，如此反复5次，拍干 阴性对照平均OD值小于0.1 阳性对照平均OD值大于1.2，实验结果有效 CUT OFF值=2.1*阴性对照平均OD450值 注：阴性对照OD450值＜0.05作0.05计算,＞0.05按实际值计算 待测样品OD值≥CUT OFF值：阳性 待测样品OD值＜CUT OFF值：阴性 五、结果分析 检测前： 1、标本：不溶血，有标签等。 2、试剂：从冷藏环境取出的试剂应置37℃平衡 30min后使用。 3、仪器：提前预热30分钟。 六、注意事项 七、临床意义 乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。在感染乙肝病毒后2～6个月，当丙氨酸氨基转移酶升高前2～8周时，可在血清中测到阳性结果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期转阴，慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性。 如果乙肝表面抗原正常值（ng/ml）大于0.18ng/ml，那么就表示该患者体内有乙肝病毒，乙肝表面抗原而被视为阳性结果，反之被认为是阴性 八、思考题 *
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