菜心過氧化物酶的提取论文.docVIP

菜心过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析 周伟竞 （广州大学生命科学学院） 摘　要: 为了探索菜心不同部位POD 活性及同工酶的种类, 以菜心的不同部位（菜花，叶，茎）为材料, 研究其在提取后及加工过程中POD 的活性及变化情况.发现茎的蛋白含量少，但POD活力强, 菜花的蛋白含量高，但POD的活性弱,通过同工酶的凝胶电泳分析，知道了花有两种同工酶，叶有三种同工酶，而茎只有一种 关　键　词:菜心 过氧化物酶 活性 同工酶 The Extraction of Peroxidase from Chinese Cabbage ， Its Active Property and the analysis of PAGE Abstract: In order to explore different parts of cabbage types of POD activity and isoenzyes to different parts of cabbage (cauliflower, leaves and stems) were used to study in the extraction and processing of POD activity and changes. Found stem less protein, but POD activity is strong, cauliflower protein content, but POD activity is weak,by isoenzyme gel electrophoresis analysis, there are two isozymes known flower, leaf, there are three isozymes, the stem is only one Keywords: cabbage peroxidase active isoenzymes 前言:过氧化物酶(POD)是广泛存在与各种动物、植物、微生物体内的一类氧化酶。过氧化物酶以西红素为辅基，参与了许多重要的生理过程如：细胞壁的合成，应激反应，生长调节等等 。过氧化物酶在植物细胞内主要分布在细胞壁，液泡，输导组织及膜结合核糖上。迄今过氧化物酶作为一种商品试剂也广泛用于免疫组织化学，电镜技术，酶联反应等生物学研究，并成为重要的诊断试剂。本试验对菜心中的过氧化物酶进行提取、分离、纯化，活性测定及同工酶的凝胶电泳分析较为系统地对菜心POD进行了研究。同工酶是来源于同一个体或组织, 能催化同一反应, 而酶蛋白结构不同、物理化学性质不同的一组酶.由于酶是基因表达的产物, 所以同工酶可用于鉴定基因型的差别, 也可作为研究生长发育的重要工具, 并且对于研究植物的抗病性也有帮助. 1 实验材料和方法 1．1 材料 新鲜菜心(购自附近市场)的花，叶，茎 1．2 仪器 电子天平 冰冻高速离心机 可见光分光光度计 电动玻璃匀浆机等 电泳仪 电泳槽 注射筒及针头 微量注射器 装凝胶用玻璃管（内径为5毫米、长度为90毫米）、 1．3 试剂 20mM KH2PO4， 100mM PBS：取0.2M Na2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。 标准和待测蛋白质溶液 标准蛋白质溶液（各配100ml）：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。未知蛋白质溶液。 三羟甲基氨基甲烷（Tris），四甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺（Bir），甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝，联苯胺，过氧化氢。 1．4 酶液的制备 1、称取植物材料1-2克，剪碎； 2、加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，再加入7ml KH2PO4研磨，后加入离心管中； 3、8500rpm， 15min； 4、取上清液，定容至10ml（刻度试管）。 此液即为POD提取液，取5ml冷冻保存，作为电泳的POD样品。 1．5蛋白浓度的测定—考马斯亮蓝法 标准曲线 制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值) + b， 得出相关系数R2。 根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。