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雷公藤多苷片高效液相指紋图谱的研究
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雷公藤多苷片高效液相指纹图谱的研究
杨春欣,梁 健,沈 熊,吕迁州
(复旦大学附属中山医院药剂科药学研究室,上海 200032)
摘要:目的 雷公藤多苷片有抗炎及抑制细胞免疫和体液免疫等作用,是治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、皮肤病等自身免疫性疾病的药物。目前雷公藤多苷片质量控制标准还不太完善,建立雷公藤多苷片的高效液相指纹图谱,为全面而有效地控制雷公藤多苷片的质量,对临床用药的有效性和安全性有很大的意义。方法 取不同生产厂家的雷公藤多苷片,采用高效液相色谱法,色谱柱为Diomonisl C18分析柱,检测波长为218nm,柱温为35℃,以水-乙腈为流动相,1.0mL·min-1 的流速,梯度冼脱。结果 获得雷公藤多苷片的指纹图谱。其指纹图谱的方法有较好的重现性、精密度和稳定性。不同样品的高效液相指纹图谱的主要峰基本一致,提示不同厂家及批号的雷公藤多苷片的主要成分基本相同,但含量有所不同。确定了18个峰为雷公藤多苷片的共有峰,初步建立了雷公藤多苷片的HPLC指纹图谱,为衡量其质量优劣提供了依据。结论 利用雷公藤多苷片HPLC指纹图谱可以较好地反映雷公藤多苷片的内在质量,且该方法简便,快速,有效,灵敏,有助于雷公藤多苷片的质量控制。
关键词:高效液相色谱法,指纹图谱,雷公藤多苷片,雷公藤内酯醇
雷公藤多苷片是卫矛科(Celastraceae)雷公藤属雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f. )的干燥去皮根经提取、纯化后得到的有效组分。雷公藤多苷片与其它雷公藤制剂相比具有用量小,不良反应少等优点[1],雷公藤多苷片广泛应用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、白塞氏三联征、麻风、自身免疫性肝炎及皮肤病等疾病,疗效显著,其生理活性是由二萜内酯、生物碱、三萜等多种成分协同产生[2]。雷公藤多苷片是目前临床上使用较多的非甾体类免疫抑制剂。
目前国内雷公藤多苷片至今还没有很完善的质量控制标准,仅对雷公藤内酯醇或雷公藤内酯甲进行控制[3,4,5],以至不同厂家的产品存在不同程度的差异,为了准确地控制雷公藤多苷片中有效成分群的含量,建立雷公藤多苷片的指纹图谱[6],对其临床用药的有效性和安全性有很大的意义。
1 仪器与材料
Gillson 高效液相色谱仪系统,包括:306型泵,119紫外/可见光检测器,715色谱处理系统,Rheodyne 9125型进样阀,配以20 μL采样环,805测压仪,811C动态混合器,Gilson818柱温箱。EYELA旋转蒸发仪N1001型 (日本东京理化器械株式会社)。B2500S-MTH型超声波清洗仪(上海必能信超声有限公司)。AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。雷公藤多苷片A~H共8个批号(上海复旦复华制药厂和江苏泰州美通制药厂);雷公藤内酯醇对照品,含量99.53%,雷公藤内酯甲,含量99.17%,均购自上海科卫医疗技术研究所。中性氧化铝,上海五四化学试剂厂生产;微孔滤膜,孔径0.45μm,上海半岛实业有限公司净化器材厂生产。乙酸乙酯,分析纯;乙腈(色谱纯 ,美国Fisher公司);自制纯水;其他溶剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备:采用均匀取样法从雷公藤多苷片取出15片,研细成粉,精密称取400mg,置于25mL三角烧瓶中,加入20mL乙酸乙酯,超声提取30min,过滤,滤液过15 g中性氧化铝柱,用30mL乙酸乙酯洗脱,收集全部过柱后的洗脱液,回收乙酸乙酯,得残存物,加1.5mL乙腈溶解,0.45μm微孔滤膜过滤,备用。
2.2 雷公藤内酯醇对照品溶液的制备:精密称取干燥恒重的雷公藤内酯醇对照品0.00081g,用乙腈溶解并定容在10mL容量瓶中,制成浓度为0.081mg·mL-1对照品溶液,备用。
2.3 色谱条件:色谱柱:Dikma公司Diamonisl C18 (250 mm×4.6mm,5μm);流动相: 水(A)-乙腈(B),梯度洗脱:0~70min,A: 65%~0%,B:35%~100%;流速:1.0mL·min-1 ,检测波长: 218nm;柱温:35℃;进样体积:20μL。
2.4 指纹图谱方法学建立与考察
2.4.1检测波长的比较:
2.4.2不同流动相及洗脱方法的比较:采用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同流动相进行等度或梯度洗脱,结果发现含有磷酸的流动相并不能改变峰型。采用梯度洗脱, 可兼得二者的优点。见表1。
表1 梯度洗脱方案
方案
时间(min)
乙腈(%)
水(%)
1
1 → 15
15 → 40
35
35 → 100
65
65 → 0
2
0 → 40
40 → 100
60 → 0
3
0 → 60
40 → 100
60 → 0
4
0 → 30
30
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