实时定量PCR分解.pptVIP

* 特异性强，准确性高 对引物和试剂要求不高 常被用作基因含量的精确检测和基因表达变化的精确分析 荧光阀值（threshold）： PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即threshold=10×Sdcycle 3-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 定义：扩增DNA的量达到荧光阀值时的循环次数。 RNA的质量和定量 引物和探针的设计 内参的正确选择 反应体系的优化 操作规范 序列选取在基因的保守区域 避免引物自身形成环状发卡结构 最好跨两个外显子 引物长度18-24bp 产物长度80-150bp，不超过300bp BLAST分析特异性 引物设计原则同染料法 引物Tm值60 ℃左右，探针Tm值70 ℃，探针Tm值比引物高5-10 ℃，为了确保探针先于引物结合 探针的5‘端不要是G，G有淬灭作用 探针长度为15-45bp 高度或中度表达水平 稳定表达于不同类型的细胞和组织 表达水平与细胞周期或细胞是否活化无关 表达水平与内源性或者外源性的刺激无关 常用内参GAPDH，beta-actin，18srRNA 模板浓度不要太高，反转录最多1ug总RNA PCR一般1ul反转录产物 引物浓度一般100nM-1mM 根据Kit要摸索最佳反应条件 每管或每孔都要换新枪头 每个样品至少要做3个平行孔 每组实验做3个重