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第四章 基因组DNA分析 有关基因组研究的不同方面 基因组学：主要是获得DNA序列，并将序列正确组装的一整套的实验技术 后基因组学：功能基因组学，对序列进行分析、定位基因、调控序列、确定未知基因的功能 生物信息学:通过计算机来帮助基因组和后基因组学的研究。 第一节 基因组的组成 Genome（基因组）：指一套染色体中遗传物质的总和。不包括：线粒体DNA，叶绿体DNA。 染色体分析法：核型、带型和荧光分子杂交 通过染色体原位杂交显示真核细胞染色体上基因的位置 原位杂交 染色体原位杂交 通过染色体原位杂交显示真核细胞染色体上基因的位置 第二节：基因组作图 基因图谱(遗传图谱)原理（连锁作图） 基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。 用DNA标记进行遗传作图的过程 构建遗传图谱的主要环节： 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体。 对群体中不同个体的标记进行基因型分析。 借助计算机程序构建连锁群 问题?怎么进行基因型分析? DNA 分子标记 1.RFLP标记的原理 基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片段长度多态性。 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）: 基因组种特定的位置，两个或两个不同的核苷酸出现在该位置上，称为单核苷酸多态。 短串连重复：又称微卫星DNA，由1～13个碱基组成的基序串连重复而成的DNA序列，一般比较短，广泛分布在基因组的不同位置。在微卫星DNA序列的两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据这些DNA序列设计特异的引物。 物理图谱 直接在染色体DNA分子上定位特定。 直接检查染色体DNA分子，如用荧光原位杂交 用染色体缺失－附加系进行定位 四、用遗传资料、DNA标记和克隆片段来构建克隆重叠群法 随机选择一个克隆作为探针筛查文库，得到阳性克隆 将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列)作为新一轮筛查文库的探针； 得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列)是重叠的，共有的。即这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的 再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因 12.1.2 克隆重叠群法 问题：如何能够快速组装重叠群？ 方法：散布元件PCR 序列标签位点 第三节 长的基因组DNA片段的操作 一、用荧光标记法来分拣染色体 流式细胞仪 二、标签克隆方法 三、染色体的显微切割 四、脉冲电场凝胶电泳 第四节 基因组DNA克隆载体 一、粘粒的结构特征和用途 粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有cos 序列的质粒。 cos序列是λ噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。 粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。 它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。 二 、酵母人工染色体 三、细菌人工染色体（BAC）载体 BAC（bacterial artificial chromosome） A、以大肠杆菌 （E. coli）F性因子为基础构建的载体。 B、特点： 容纳大约200Kb的片段 可以像大肠杆菌的质粒一样繁殖（低拷贝，严谨型） 在宿主细胞中不会发生重组 P1以及PAC载体（Pl-derived Artificial Chromosome） A、 P1载体 组件： 包装位点（pac）：体外包装重组子称为噬菌体粒子所必需。 两个loxP位点：能被噬菌体重组酶（cre基因的产物）所识别 结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。 包装位点（pac）：体外包装重组子称为噬菌体粒子所必需。 两个loxP位点：能被噬菌体重组酶（cre基因的产物）所识别 第四节 基因组DNA克隆载体 六、用DNA池来筛选基因组文库 第四节 基因组DNA克隆载体 首先在10个FP板的上进行PCR筛选（10x96=960个PCR反应） 对应在FP1板G3位点阳性克隆，在TP1-TP4板对应于G3孔做PCR反应，总计4个PCR。 如筛选出来的是T