第四章 生物样品预处理.pptVIP

生物样品预处理与色谱分析法的建立及评价 段更利 第一节 生物样品的种类、采集和储存 一 生物样品的种类和选取原则 常用的生物样品有血样（血浆、血清、全血）、尿 液、泪液、脊髓液、胆汁、羊水、脑脊液等。 选取原则： 1 要反映出浓度和药物效应之间的关系 2 易于获取 3 便于样品处理，易于分析 4 根据不同目的和要求选取 （一）血样 血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的体内药物分析的样品。 血浆是将加入肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。 血清则是不加抗凝剂，由血液中纤维蛋白等影响下，引起血块凝结而析出，离心取用。 全血（whole blood）也应加入抗凝剂，防止凝血。 （二）尿样（urine） 尿样主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率核生物利用度等研究，以及代谢物类型等。 尿中药物大多成缀合状态，所以为了测定尿液中药物总量，一般需要将缀合药物游离。 （三）唾液（saliva） 唾液作为样品的优点是：样品容易获得，取样无害性，有些药物在唾液中游离的浓度和血中游离的、即未与蛋白结合的药物浓度相等。 （四）粪便（stool） 新鲜粪便收集之后应该立即冷冻处理，必须将药物进行分离、纯化等措施，最常用液液萃取法。 （五）动物内脏及组织 在动物实验中，为了了解药物在各脏器、组织中的分布、积蓄或研究药物的代谢分布， 通常将动物脏器、组织如心、肝、脾、肾、肌肉、胰腺等取样、称重，制成匀浆，然后用溶剂萃取法把药物提取出来。如果不是立即处理该类样品，应将样品用称量纸袋一一分装好，再立即冷冻备用 。 二 样品的储存和稳定性考察 血浆和血清需要在采血后及时分离。 尿液主要成分是水，尿素及盐类，取样后应该立即测定，否则应该放置冰箱冷藏或加入防腐剂保存。尿冷藏一般多放置于4℃冰箱中，常用的防腐剂有甲苯、氯仿。 分析样品在贮存时应该考虑：1 样品应储存在什么条件下；2 这些样品在储存期会对分析结果产生什么影响； 3 如果这些样品不稳定，如何预防或者校正分析结果。常用的检测稳定性的方法有二种：重复测定；在预期范围内配制标准样品后贮存，与所贮存样品一起分析，观察变化。 第二节 生物样品预处理的目的及各种方法 一 生物样品预处理的目的 1 减少对于测定的干扰以及对色谱柱的污染 2 达到检测器的灵敏度 3 提高检测的灵敏度和选择性 二 生物样品预处理的各种方法 溶剂萃取法 离子对提取法 去蛋白法 冷冻干燥法 固相萃取法 试样在线预处理法 衍生化处理法 （一）溶剂萃取法 溶剂萃取法是应用的最多的分离、净化方法，目的是从大量共存物中分理出所需要的微量组分– 药物以及代谢物，并且使样品得到浓集。 溶剂萃取法中主要考虑的问题有：溶液的pH，溶剂的极性和保持提取效率的重现性。 1 溶液pH值的调节 溶剂提取时，水相的pH值一般应该使待测药物 主要以非电离形式存在；故碱性药物最佳的pH要高于pKa值1~2个pH单位，酸性药物则要低于pKa值1~2个pH单位，从而可以使90%的药物以非电离的形式存在，对于中性药物则在pH7附近提取。对于有些碱性药物在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。 对于高度电离的极性化合物，则很难用有机溶剂从水相中定量提取出来，往往需用“离子对”技术进行提取和定量。 2 提取溶液的极性 液液萃取中采用的有机溶剂多是既能满足提取需要而又是尽可能小的极性溶剂，从而既可以得到合适的回收率，又使干扰“杂质”的提取量减至最小。 有时候也利用不同极性的混合溶剂来提取药物和净化脂肪酸类。 液液萃取法中常用的有机溶剂 3 提取技术 提取溶剂的用量 加入有机溶剂与水相的体积一般为1：1或者2：1或小于10：1，多进行一次或两次提取，多采用内标法。 混合 密塞情况下将试管平置于振荡器内振荡，或者试管竖直放在涡动混合器上旋摇。 离心与分离 通常离心机4000rpm，离心10min分离出有机相。 提取溶剂的蒸发 常用减压蒸发法或者吹氮气流失溶剂挥散。 4 结合物水解 结合物水解 （1）酸水解：常用无机酸，如HCl。酸水解简便、快速，但是不具备专一性。 （2）酶水解：专一性很强，常用有β-葡萄糖醛酸甙酶等。该方法温和，但是时间长，费用增加，并且可能引入粘液蛋白等杂质。 （3）溶剂解：某些药物的硫酸酯，往往可随加入的萃取溶剂在萃取过程中发生分解，成为溶剂解。 （二）离子对提取法 两性药物或者水溶性很强的药物不能用一般的溶剂萃取法将它们从体液介质中萃取出来，通常可以使用离子对萃取技术（ion pair extraction）。 体液样品中的药物用离子对萃取时，最常用的萃取溶剂是氯仿和