学习课件第09章PCR技术hu.ppt

11.2.3 生态及海洋生物学 对分析来说，传统分子技术所需的组织样品用量相对较多。尤其是许多无脊椎动 物，它们对于进行分子检测所用的一般操作方法来讲太小。因此，对于小生物、共生 生物或那些在培养基中不易生长的生物个体的直接分析是困难。聚合酶链反应有和来 扩大能进行分子检测的生物范围。现在可以直接研究象原生物和藻类等单细胞生物自 然种群的基因结构。此方法在生物的分布及数量分析中会有广泛的应用，尤其是用于 海洋环境中的生物。最后，聚合酶链反应的敏感性使其可以检出及鉴定少量的单细胞 生物、共生生物及寄生生物，既使样品是来自后二者宿主的DNA混合物中也可检出。 11.2.4 无损伤样品检验 用于基因分析的样品一般都需要采血样或取组织。这就限制了基因分析在行为学 及生态学研究中的应用，在这些领域中必须把对象所受的干扰减到最低。从诸如单根 头发等法医学样品中扩增序列为行为科学家及保留生物学家提供了一个新机会。无损 伤样品检验也使收集用于研究的危险生物的样品变得容易。 11.2.5 分子研究和生物体研究的协同 通过分子分析所开辟的物种研究新领域，我们希望在分子生物学家及种群生物学 家之间建立大量的相互合作。例如为系统发育的重建所收集的比较序列可清楚地显示 出蛋白质的结构及作用。通常不在实验室里进行的，对适应独特环境的生物体的分子 研究可能会揭示独物的分子适应性变化。相反，对遗传变异体的分子结构的了解也有 助于我们了解生物体是如何进化的。 11.3 单个细胞的PCR分析 11.3.1 单个二倍体细胞 在分析单精子以前，Li等人对个体二倍体细胞内的β珠蛋白基因进行过研究。两 个组织培养细胞株用于这些实验。其中一个纯合是镰刀型细胞密码子6（βS）发生突 变，另一个纯合子则来源于正常的βB等位基因。扩增含有密码子6的β珠蛋白片段的 引物，及能够区别这两个特异的等位基因的寡核苷酸探针（ASO）已经报道过。βA纯 事细胞和βB纯合细胞和βS纯合细胞在同一组织培养瓶中共同培养数天。将用相差显微镜观察到的混合培养的单个细胞转入溥塑料胡管内。分别将单个细胞转入含裂解液 的PCR管中，保温后，加入PCR缓冲液，缓中有四种dDNP．Taq DNA聚合酶和扩增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分钟变性靶DNA，然后根据已发表方法的改进方案进行 50全循环的扩增。通过打点杂交，等量的扩增产物打点于尼龙膜后，扩增产物分别与 βA和βS的探针杂交。所分析的37个细胞中，84％细胞只与βA和βS探针杂交，杂交 强弱各不相同；19个与βA探针．12个与βS探针杂交。12个以水作空白对照的反应管 中瓜呈阴性，它表明忽略不记DNA的污染。没有与两种探针都杂交的样品，它暗示转 入到反应管中的单个细胞，而且组织培养基中存在的从βA或βS细胞中裂解出来的 DNA并未吸附在单个细胞上。 单个细胞的PCR扩增产生的β珠蛋白基因的数量通过与已知携带蛋白基因的质粒 DNA样品在杂交模上的杂交信号的强度进行比较确定。据估计PCR反应开始时，一个二 倍体细胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩尔）在5－500毫微微摩尔之间，每个PCR循环以 平均效率65％计算，经50个循环后它的DNA相当于平均扩增了7.6×1010倍。考虑到扩 增的程度之大，因此排除任何可能的污染对于单个细胞的分析十分关键。 11.3.2 单精子的分析 Li等人随后对位于染色体19编码LDL受体(LDLr)的基因的杂合体单精子的基因型 进行分析。根据已知的DNA序列，他们用PCR和ASO分析检测LDLr的RFLP。PCR的引物和 探针以前已有报道。单个精子的分离与二倍体细胞的分离方法一样，精液经蔗糖梯度 离心得到纯化的精子，精子于－20℃可保藏8个月。显微镜下将单个精子吸入毛细塑 料针管内，然后转入试管内以作裂解。裂解的方法与发表的方法冲液(50mM KCL， 10mM Tris.HCL，pH8.3，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明胶），0.05mg/ml蛋白酶K，20mM DTT和1.7μM SDS。37℃保温1小时，加入PCR反应物以前，样品加热到85℃。PCR扩 增。对80个精子LDLr基因型已作过分析。55%的雄配子显示出杂交信号。22个携带 LDLr等位基因，21个携带LDLr2基因。仅一个与两种探针杂交都呈阳性。16支对照反 应管中加入所有反应试剂但没有精子，结果无杂交信号出现。两个扩增的等位基因的 分布遵循Mendel独立分离定理，它表明PCR反应以单个减数分裂产物为起始，无污染 的二倍体DNA存在。 Li等人随后又对进行重组研究十分关键的单精子的两个不同基因座的DNA序列进 行扩增。供体雄配子的第六条染色体上的HLAAQα基因座及第十九条染色体上的LDLR 基因是杂合的。最初想在LDLR和DQ