10实验十试血.pptVIP

实验二 实验动物血清分离 剪尾采血 此法每鼠可采10次以上。 小鼠每次0.1~0.2ml。 大鼠每次0.4ml。 眼眶后静脉丛采血 小鼠每次0.2~0.3ml。 大鼠每次0.5ml。 二、大白兔采血方法 　 1、耳静脉采血 2、耳中央动脉采血 3、心脏取血 4、后肢胫部皮下静脉取血 　 5、股静脉、颈静脉取血 采血量 耳缘静脉采血：5-10 ml。 耳中动脉采血：15 ml。 心脏采血：20-25 ml。 三、血清分离 对于小量采血： 1. 将血液置室温中凝固约1小时，然后置4℃过夜，使血块收缩。（可省略） 2. 离心管配平：称取装血液离心管的重量，取一支干净离心管，加入自来水至等重。（非常重要！） 3. 将收集血液于4℃下2500 rpm离心5分钟，取上清液。 4. 配平后，将上清液于4℃10000 rpm离心15秒，弃沉淀收集上清，即为血清。 5. 短期于4℃保存；长期保存，需添加防腐剂后冷冻保存。 实验原理 在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应的抗体（或抗原），在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。 试剂与器材 1. 1％鸡红血球 2. 抗鸡红血球的免疫血清 3. PBS 4. 凝集板 操作方法 1. 血清稀释： 取1.5mL无菌尖底离心管8支排列于离心管架上并做好标记，第一管中加入PBS 0.18 ml，其余各管加入PBS 0.2ml，吸取免疫血清0.02ml，加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出0.2ml加入第2管中，经充分混匀后吸出0.2ml加入第3管中，如此依次2×稀释至第7管，混匀后吸出0.2ml弃去。此时1-7管所含免疫血清的稀释度为1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640，第8管不加免疫血清做为阴性对照。 操作方法 2. 取清洁血凝板两块，注明号码。于1～4格中依次加入不同稀释度的抗血清0.2ml，第5格加阴性血清0.2ml ，最后一格加PBS 0.2ml 。 3. 在各格中加入鸡红血球0.2ml 。 4. 轻轻摇动凝胶板，经1～2分钟后用肉眼观察结果，出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。 判断标准 A．++++：完全凝集，呈厚膜状铺于板底，边缘呈锯齿状。 B．+++：呈薄层贴于凝集板，边缘不齐。 C．++：中央呈较小园盘状沉淀，边缘凝集呈颗粒状。 D．+：呈较大的园盘状沉淀，边缘有少量凝集颗粒。 E．-：无凝集，细胞沉于板底园盘状。 效价判断 效价： 将待检血清进行倍比稀释后，加入等量抗原进行反应。能够使50％红细胞发生凝集的最大血清稀释倍数为血清的效价。 实验原理 位于凝胶小孔中的抗原和抗体，当两者相对扩散时，经一定时间后，若两者能特异性结合，会在琼脂小孔间、两者最恰当的比例处形成白色沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状以及对比各沉淀线之间的关系，可对抗原或抗体进行定性、定量分析。 实验材料 1．抗原：可溶性抗原BSA； 2．抗血清：抗BSA的高免血清； 3．试剂：0.01 M PBS（pH7.2），琼脂糖； 4．其它：9 cm培养皿，200 μL微量可调加样器及吸头，1.5 mL无菌尖底离心管，打孔器。 实验步骤 1．1%琼脂糖配制： 称取琼脂糖0.4克，加入PBS 40 mL，电磁炉上小功率加热，使琼脂完全溶化。 2．铺平板： 取干净9 cm培养皿1个平放于实验台（台面要水平），将融化的1%琼脂糖趁热倒培养皿中（约加30 mL），使琼脂糖厚度达6 mm，盖上打孔器，待琼脂糖冷却凝固后，轻轻取下打孔器，在琼脂中形成小孔。 3．抗血清稀释： 取1.5 mL无菌尖底离心管6支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入PBS 50 μL，吸取免疫血清血清50 μL加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出50 μL加入第2管中，经充分混匀后吸出50 μL加入第3管中，如此依次2×稀释至第6管，混匀后吸出50 μL弃去。此时1-6管所含免疫血清的稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。 6．加样： 在每组呈梅花状排列的小孔的中央孔中加一滴BSA抗原30 μL，周围孔依次加不同稀释度免疫血清。加样时将每孔加满即可，注意不要溢出孔外，做好标记。 7．孵育 盖上培养皿盖，放37℃湿盒中温浴24～48 h。 8．结果观察 将培养皿从塑料盒中取出，在散射光的背景下观察，或在凝胶成像系统上用白光光源观察中央孔与周围适当稀释的抗体孔之间的白色沉淀线，有沉淀线为阳性，否则阴性。 效价判断： 在一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度即为血清效价。 * 1、割（剪）尾采血 2、眼眶静脉丛采血