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医学微生物学实验 结果观察 抑菌圈直径≥15mm高度敏感 抑菌圈直径10-15mm 中度敏感 抑菌圈直径≤10mm低度敏感 无抑菌圈不敏感或耐药 注意事项 接种时均匀密涂 贴片时，用无菌镊子轻轻触压药物纸片使之与培养基充分接触 贴片后不能再更改纸片位置 镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响 整个贴片过程应在15min内完成 2.密涂接种 分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转60度二次密涂接种，然后同方向旋转60度后再次密涂接种。 顶部观 3.贴片 底部观 4.培养 置37℃温箱， 倒置培养18h-24h 青霉素 链霉素 庆大霉素 氯霉素 五、 结果抑菌圈 抑菌圈直径主讲：马玉龙Tel:1座机电话号码13Email:looksea99@126.com 新乡医学院微生物学教研室：座机电话号码科教科：座机电话号码 注意！本次实验部分涉及生物危险粪便中致病微生物，请谨慎操作无菌操作！ 内 容 提 要 一 肠道杆菌的鉴定（2学时）革兰染色（1片/人），双糖铁培养 基接种（8支/室），玻片凝集试验（1片/人） 二 药敏试验（0.5学时）介绍及展示示教平板 三 抗酸染色（2.5学时）示教，1片/人 一 肠道杆菌的鉴定（2学时） 病原菌的检验程序 增菌培养 革兰染色 分离培养 接种琼脂斜面纯培养 采集标本 生化试验 血清学试验 动物试验 分析鉴定 革兰染色 观察菌落特征 概念：用生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试验。 意义：是鉴别细菌的重要依据。 1.细菌的生化反应 生化反应 碳水化合物 代谢试验 各种酶类试验 抑菌试验 糖发酵试验 甲基红试验 V-P试验 蛋白质和氨基酸代谢试验 硫化氢试验 吲哚试验 碳源和氮源 利用试验 枸橼酸盐利用试验 IMViC试验 糖发酵试验 [原理]根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。 1、确定细菌是否生长 2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。 3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“　　”表示。 4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。 [结果] [方法]取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置37℃温箱培养18－24小时，观察结果。 大肠杆菌 伤寒杆菌 副伤寒杆菌 葡萄糖+ 乳糖-- 硫化氢产生试验 [原理]某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。 [方法]分别穿刺接种大肠杆菌、伤寒杆菌至两管双糖铁培养基中。37℃孵育24小时后观察结果。 [结果] 沿穿刺线部位呈黑褐色， 表明有硫化氢产生，为阳性以“+”表示， 不变色者为阴性，以“-”表示。 大肠杆菌：- 伤寒杆菌：+ 2.肠道杆菌的鉴定 实验目的：熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程 粪 便→增菌培养（必要时）↓SS 培养基↓双糖铁培养基┒↓↓生化反应 血清学鉴定←┛ 肠道杆菌的鉴定程序 已完成 革兰染色 大肠杆菌在SS平板上的菌落特点； 伤寒杆菌在SS平板上的菌落特点； （1）观察SS平板上菌落特点SS平板 大肠杆菌粉红色大菌落 痢疾杆菌无色细小 半透明菌落 伤寒杆菌无色细小 半透明菌落 （2） 双糖铁培养基接种 双糖铁培养基成分 含有乳糖和葡萄糖：产酸产气 含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成硫化氢，可形成黑色沉淀 酚红指示剂：酸：黄碱：红 各菌的生长特点 1大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），是斜面及底层均呈黄色并有气泡。 2 沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖，不发酵乳糖，分解葡萄糖产的酸使培养基pH下降，酚红指示剂变黄，但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用，使斜面变红，而底层则为黄色。 双糖铁培养基接种方法将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺+斜面 ），37度培养24小时，第二天观察结果。 双糖铁培养基上各菌的生长现象 大肠杆菌 黄色有气泡 伤寒杆菌 上红下黄中间有黑色沉淀 福氏痢疾杆菌 上红下黄 冲洗 染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果 （3）革兰染色方法与步骤 1、细菌涂片的制备涂片干燥固定 2、染色初染（结晶紫）媒染（卢