微生物研究法D组..pptVIP

微生物研究法D組 報告者：曾仁志 報告日期：2005/9/19 培養基pH值的變動對細胞造成的影響 哺乳動物細胞最適生長的pH範圍為7.2~7.4，過酸或過鹼都會對細胞生長不良或造成傷害，故讓培養基的pH值穩定是相當重要。 For example：Articular Chondrocytes關節軟骨細胞，主要的能量來源是透過糖解作用之無氧代謝，Pyruvate轉換成 lactic acid，會迅速酸化培養基而導致抑制細胞生理及代謝。 CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對培養基pH值的調控 培養基的pH buffer system最常用NaHCO3加入培養基中，以CO2來調整pH在適當之範圍 HCO3- + H+H2CO3CO2 + H2O。 ※細胞生長需要CO2的環境，然而在CO2 incubator不斷的補充CO2下，培養基會越來越酸。加sodium bicarbonate進去，使HCO3- 去抓住H+ 來平衡pH值。然而在細胞生長快速及carbonic anhydrase的存在下，培養基會酸化的更快，故以添加HEPES來穩固細胞生長最適之pH的環境。 CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對培養基pH值的調控 以HEPES當培養基之緩衝液之優缺點 優點：對細胞毒性較小，適用於多種類型細胞的培養。參見表一 參考資料 表一、各種常用緩衝液及其使用範圍 Phosphate buffer with or without Ca2+ Phosphate buffer without Ca2+：多應用於細胞培養之沖洗。With or without Ca2+ ? Why ? Phosphate buffer with or without Ca2+ Phosphate buffer與鈣離子結合沉澱的原因： 溶液的pH值 在溶液中，磷酸鹽是以三價的磷酸根（PO43-）、二價的磷酸氫根（HPO42-）和一價的磷酸二氫根（H2PO4-）存在，這三個離子會維持一個平衡的狀態，但是PO43-要在強鹼（pH值很大時）的情況下才會存在，所以在phosphate buffer溶液中只可能以HPO42-及H2PO4-存在。 HPO42-較會和鈣離子產生沉澱。在pH值7.4時會有80%的HPO42-存在，較會和鈣離子產生沉澱；若pH值下降至5.4時，則有96%的H2PO4-的存在，這樣一來就減少產生磷酸鈣沉澱的機會。所以溶液pH值影響鈣磷沉澱很大，pH值較低時，發生沉澱的機會也較低。 Phosphate buffer with or without Ca2+ 成立一個細胞學實驗室的基本需求 設計細胞實驗室之基本考量 細胞培養最害怕的就是污染的問題，因此提供一個無菌的設備、環境及無菌操作技術是十分重要的。 設計細胞實驗室之基本考量 設計細胞實驗室之基本考量 細胞培養室與其他工作室隔離，需有2~3道門，要有緩衝區來更換鞋子與實驗衣。 設計細胞實驗室之基本考量 細胞培養箱、冰箱、桌上型離心機、顯微鏡等設備 。 細胞實驗室之基本配備 細胞實驗室之基本配備 其他設備1.水浴槽2.液態氮3.-20℃ 、-80℃ 、4℃ 等冰箱。4.其他的視實驗需求而定。 參考文獻 Fisk A., Pathak S., 1969 HEPES-buffered medium for organ culture. Nature. 224, 1030-1031. Waldman S.D., Couto D.C., Omelon S.J., Kandel R.A., 2004 Effect of sodium bicarbonate on extracellular pH, matrix accumulation, and morphology of cultured articular chondrocytes.Tissue Engineering. 10, 1633-1640. * * 題目：1CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對培養基pH值的調控。 2成立一個細胞學實驗室需要什麼需求。 Glucose Glycolysis Glucose-6-phosphate Pyruvate Lactic acid pH↓ Cell 盡可能避免光照 缺點：長期暴露於光照下，會產生具細胞毒性之自由基。但是只要避光保存便可避免，此問題較易解決。 小心會與金屬離子結合沉澱。 9.7~10.7 Carbonate pH值受溫度影響很大。 7.1~8.9 Tris 毒性較小多用在細胞培養。 6.5~8.5 HEPES 小心會與鈣離子結合沉澱，低溫下易結晶。 5.8~8.0 P