双萤光素酶基因技术讲课.ppt

Report Smartly　　　　－萤光素酶报告基因技术 自然界的萤光 自然界的萤光 报告基因的作用 细胞信号转导途径 启动子/增强子 受体结合 病毒/细胞相互作用 转录因子 药物诱导作用或”效果” 各种报告基因的优点和缺点 萤光素酶报告基因的主要优点 非放射性 检测快（比CAT等） 灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍） 半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20 摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时） 线形范围广 （在10-16 M(10pg/L)至10-8 M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比） 一般比显微镜检测的荧光更灵敏 (对多孔板而言) 生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器 通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力 萤光素酶报告基因的使用 原理: 制备含有 luc/ Rluc 的DNA 转染 提供刺激 测量萤光 在活细胞中做报告基因检测 启动子/增强子分析 “碰撞启动子”: 全序列: 2) 逐步缺失: 萤火虫生物萤光的化学 海肾萤光素酶反应 Enzyme structures 为什么要使用双报告基因 细胞可能有内源脱乙酰基酶 ?-Gal 或 GUS 活性.  CAT, ?-Gal 和 GUS 检测是终点