9.28.2015-荧光定量PCR技术-孟丹.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * 2-ΔΔ Ct法 相对定量举例 相对定量分析 相对定量举例 双标准曲线法  SYBR Green法实验流程 Company name 样本处理 RNA提取 qPCR 数据分析 逆转录 样本处理与RNA提取 外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照 逆转录 逆转录引物选择 RT-PCR一步法还是两步法？ 两步法: 反转录和PCR扩增分两步进行。 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检测 多个基因。便于反应优化。在工作的初期。 一步法：反转录和PCR扩增在同一管内完成。 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。在工作的成熟阶段。 总原则与普通PCR相同： 避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 - 300bp) 推荐做跨intron设计 引物设计原则 Master mix的应用 使用Master mix有效降低系统误差 -- 热启动酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10min Fast Hotstar 抗体修饰，热复活仅需几十秒 -- Buffer 反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂 -- Dye Real SYBRGreen mix RealSuper mix Master Mix ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 有不同系统，需参照仪器要求选择。 误差控制 使用Master mix 配置预混体系 设置生物学重复（不同个体） 技术性重复（复孔） 阳性和阴性对照 实验环境控制 试剂准备区 核酸制备区 反应液制备区 荧光定量PCR反应区 荧光定量PCR体系 数据分析 融解曲线：单一特异性产物 扩增曲线： -- Ct值大小 -- 各复孔之间重复性 -- 不同浓度梯度稀释的间隔性 标准曲线： -- R2＞0.980或∣ r ∣ ＞0.990 -- 反应效率尽可能高：90%-110% -- 目的基因的扩增效率接近内参基因 Trouble shooting 常见问题 可能原因 解决方法 Housekeeping gene 无信号 RNA降解 用新鲜组织提取RNA Housekeeping gene 有信号 而目标基因无信号 1. 目的基因表达低。 逆转录效率不高 2. PCR引物不良 1. 富集mRNA 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。 3. 尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。 Housekeeping gene 反应效率正常,但 目标因放大效率不高 PCR引物不良 重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段， 考虑不同剪接体 目标基因表达丰度在 样本之间异常一致 RNA被基因组DNA污染 使用跨intron 引物 用DNase处理RNA 确保RNA阴性对照表现阴性 溶解曲线出现杂峰 出现非特异PCR产物 出现引物二聚体 尝试不同PCR引物 尝试不同热循程序，升高复性温度 修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与PCR特异产物解链温度之间。 阴性对照在30个循环 以内出现信号 试剂被污染 注意区分信号是来自引物二聚体还是PCR产物 查找，替换污染试剂 使用UNG系统。 案例分析 总体原则 偶然因素 -- 操作原因 实验重复 – 生物学重复、技术性重复 机器因素– 仪器加样孔 结合扩增曲线、融解曲线、标准曲线分析 单孔和多孔分析 内参基因和目的基因对比分析 案例分析– 扩增曲线 曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。 扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象。 模板进行梯度稀释时，各浓度间隔性好。?? Ct 15-35 重复性? 扩增曲线 -- 低浓度样本没有稀释好 -- 重复性差，加样存在误差 案例分析– 扩增曲线 案例分析– 扩增曲线 无信号或Ct值偏大 内参基因和目的基因均无信号 -- RNA降解 内参基因和目的基因均偏大 -- 模板量低 -- 对未知浓度的样品应从稀释最高浓度做起 内参基因