资料一：核酸分离纯化课件.pptVIP

质粒特性介绍： 大肠杆菌染色体DNA较质粒DNA大得多 染色体DNA为线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子 Total RNA： Messenger RNA (mRNA) Ribosomal RNA (rRNA) Transfer RNA (tRNA) 核酸分离与纯化 中晶生物 核酸在体内的分部情况： DNA 真核生物：细胞核：95％ 细胞器：5％ RNA 细胞质：75％ 细胞核：10％ 细胞器：15％ rRNA：80-85％，tRNA和mRNA：10-15% 概述： 核酸包括DNA和RNA, 与蛋白质结合的状态存在 结构形式多样： 真核生物：染色体DNA：双链线性分子 原核生物基因组DNA、质粒、真核细胞器：双链环状 病毒DNA：双链/单链环状、双链/单链线状 RNA：多为单链线性分子 核酸分离纯化的原则： 保持其一级结构的完整性 完整的一级结构是研究核酸功能的最基本要求 遗传信息保存在一级结构中 一级结构决定其高级结构 一级结构决定与其它生物大分子结合的方式 排除其它分子的污染 纯化核酸样品应达到的三点要求： 无有机溶剂和过高浓度金属离子的存在 二者对酶的活性有抑制作用 其它生物大分子的浓度应该尽量低 蛋白质、多糖、脂类：影响后续分子生物学实验 去除其它核酸的污染 尽量减少DNA中RNA污染，反之亦然 排除异种生物的DNA/RNA污染 实验中应注意的几点问题： 减少化学因素对核酸的降解 避免过酸或过碱，操作时PH值多在4-10之间 减少物理因素对核酸分子结构的破坏 主要是机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解 尤其是RNA抽提过程中防止RNase对RNA的降解 尽量减少操作步骤，缩短提取过程 减少各种负面因素对核酸的降解 细胞裂解 有机溶剂的萃取、去除蛋白质及多糖 定量分析 核酸粗制品 凝胶电泳 柱吸附法 电透析法 去除凝胶等杂质 纯的核酸制品 核酸分离与纯化 DNA分离 基因组DNA分离 质粒DNA分离 凝胶DNA回收 PCR产物纯化 核酸抽提与分离 RNA分离 总RNA分离 mRNA分离 一、基因组DNA抽提 过柱离心系列 G-spin Genomic DNA Kit 动物细胞/组织，血液，植物/食品、细菌 EzWay Genomic DNA Kit, Multi 动物细胞/组织，血液，植物/食品、细菌、病毒、酵母 非过柱系列 G-DEX Genomic DNA Extraction Kit 动物细胞/组织，血液 Genomic DNA Purification Kit: 动物细胞/组织，血液、植物、细菌 G-spin Genomic DNA Kit 分离示意图 分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合 低盐浓度情况下，硅石与DNA分离 简要流程 结合 洗涤 洗脱 2.01 23-33 3 million NB4 2.0 27-36 3 million HeLa Cells 2.02 30-40 3 million B16(Mouse) 2.0 25-35 3 million SNU601(Human) 2.04 25-35 3 million SNU1 (Human) DNA纯度 DNA产量(ug) 数量（细胞） 样本 操作时间：15-20分钟 2.0 30-40 30 mg Liver(Mouse) 2.0 30-40 30 mg Kidney(Mouse) 2.01 22-30 20 mg Spleen(Mouse) DNA纯度 DNA产量(ug) 数量（mg） 样本 细胞 组织 EzWay Genomic DNA Kit, Multi 原理：同G-spin Genomic DNA kit 特点：试剂无毒性 缺点：价格相对IntRON贵 推荐： 细胞/组织、血液、植物/食品、细菌－G-spin系列 酵母－EzWay系列 病毒DNA/RNA mix－G-spin系列 基因组DNA抽提常见问题