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第三章 用于基因克隆的载体 3.5.2 噬菌粒（phagemid or phasmid） 噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb） 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA ?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。 3.3.2 ?DNA的复制 模型 （1） ?型复制 （2）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。 形成多联体?DAN分子。 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 （1）构建原理： 3.3.3. ?噬菌体载体的构建 （2）构建过程 ①在这个非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体 ④删除?DNA必须区段上常用的限制酶切点 删除?噬菌体的非必需区，留出插入空间。 （3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型： ① 插入型载体（insertion vectors)： 如 ?gt10、?gt11、?BV2、?NM540、?NM1590、?NM607 1）免疫功能失活型： 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。 EcoR I cI ?gt10 插入导致载体不能合成阻遏物，??载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。 选择标记: 如?NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。 2）?-半乳糖苷酶失活型载体： 在?基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。 感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。 LacZ’ EcoR I Charon16A 选择标记: ② 替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。 用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。 可置换区 MCS MCS 如： ? EMBL4、Charon40等。 1）? EMBL4 ? EMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。 以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。 左臂 可置换区 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I ?EMBL4 2）Charon40 Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成，片断之间有Hae I 切点。 在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。 左臂 可置换区 右臂 MCS MCS Charon40 Hae I 可取代片断中如果包含LacZ’，可用Xgal显色作筛选标记。 （4）?载体的筛选标记 ② 插入型载体 根据插入所引起的表型突变。 ① 置换型载体 ? DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。 3.3.4 ?载体的体外包装 在试管中与?噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。 （1）体外包装： 的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与? DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。 （2）体外包装过程 ① ?噬菌体外壳蛋白的合成 E 基因 的E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。 D基因 E基因突变 只合成尾部蛋白和包装识别蛋白 D基因突变 合成头部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包装DNA 提取尾部蛋白 提取头部和尾部蛋白 重组的?载体DNA 体外包装成活性噬菌体 外源的重组?DNA载体被诱发与内源性原?DNA发生重组。 （3）体外包装存在的问题： ① 包装错误： 既能包装用于生产头部蛋白的内源性原?DNA，也能包装重组的?DNA载体。 ② 重组： ③ 体外包装的容量限制： 必须在正常野生型容量的75%—105% （36—51kb）之间。 既不能超过正常野生型容量的5%； 又不能低于正常野生型容量的75% 野生型?DNA的必须区是28kb，所以?载体的最大克隆容量是23kb。（实际上为15kb）。 3.3.5 l-DNA作为载体的优点： l-DNA在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表